Mehr als 30 Jahre, nachdem Pauling et al. die Häufigkeit flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs, volatile organic compounds) im menschlichen Atem [1] beschrieben hatte, wurde eine regelmäßige automatisierte Messung nur für Ethanol im Rahmen der verkehrsbedingten Toxikologie durchgeführt. Andere ausgeatmete Verbindungen haben im medizinischen Kontext Aufmerksamkeit erregt: Ethan und n-Pentan wurden mit dem In-vivo-Grad der Lipidperoxidation und des oxidativen Stresses in Verbindung gebracht [2–4]. Es wurde gezeigt, dass Atemaceton mit dem Stoffwechselzustand von Diabetikern [5] oder Mäusen bei ketogener Ernährung [6] korreliert; eine Abnahme des ausgeatmeten Isoprens wurde kurz nach der Ozonexposition [7] und bei akuten pulmonalen Exazerbationen der Mukoviszidose [8] berichtet. Trotz eines wachsenden wissenschaftlichen Fokus auf Stickoxid und andere ausgeatmete Biomarker für Lungenerkrankungen [9, 10] bleiben Daten zu Atem-VOCs rar und wichtige methodische Fragen wie die standardisierte Entnahme, Handhabung und Analyse menschlicher Atemproben bleiben unbeantwortet. Die Gaschromatografie als am besten geeignete Methode kann durch den hohen Wasser- und Kohlendioxidgehalt von Atemproben beeinflusst werden, und es wurde kein Standard für die Auswahl von Vorkonzentrationsverfahren, Temperaturprogrammen, Säulen und Detektoren festgelegt [11]. Diese haben die Entwicklung der biochemischen Atemanalyse als klinisches Instrument behindert.
Die Lungenerkrankung bei Mukoviszidose (Zystische Fibrose, CF) ist gekennzeichnet durch chronische Atemwegsentzündungen, Produktion viskoser Sekrete, Bronchiektasen und häufig auch bakterielle Infektionen [12, 13]. Diese Faktoren tragen zu einem variablen klinischen Verlauf mit fortschreitender Obstruktion der Bronchien und Hyperinflation bei. Bewertungssysteme, die auf dem Grad der Symptome und Befunden aus Röntgen-, Mikrobiologie- und Lungenfunktionstests basieren, können in einem Forschungsumfeld und zur Definition einer Lungenexazerbation hilfreich sein. Daher basieren die meisten Behandlungsentscheidungen weiterhin auf klinischer Beurteilung und sekundären Parametern, die aus Lungenfunktionstests, Thoraxradiografie oder Blutanalyse abgeleitet wurden [14].
Klinische Studien stellen die Hypothese auf, dass ausgeatmete VOCs in Atemproben von Mukoviszidose-Patienten und passenden gesunden Kontrollen reproduzierbar bestimmt werden können und dass die Lungenaustauschrate dieser potenziellen biochemischen Marker mit anderen Deskriptoren der Mukoviszidose zusammenhängt.
Hoher klinischer Wert durch Quantifizierung der Metaboliten-VOCs
Ziel einer Perspektive von Smith und Španěl [18] war es, klinisch sinnvoll umsetzbare Ansätze für die Atemforschung vorzuschlagen. Nach einem Diskurs über die Herausforderungen und Erwartungen in der Atemforschung wird daher ein kurzer Hinweis auf die Analysetechniken gegeben, die derzeit für die Analyse von sehr feuchtem Atem-Exhalat verwendet werden. Die bahnbrechende Arbeit, die mit GC-MS durchgeführt wurde, ergab, dass das Atem-Exhalat eine große Anzahl von VOCs enthält. Leider wird die Analyse dieser wertvollen GC-MS-Daten meist mithilfe von Chemometrie durchgeführt, um den VOC-Gehalt von Atemproben von Patienten und gesunden Kontrollpersonen zu unterscheiden, und eine zuverlässige Quantifizierung der VOCs wird selten als notwendig erachtet. Dieser eingeschränkte Ansatz ignoriert die Anforderungen klinisch akzeptabler Biomarker und versäumt die Möglichkeit, Beziehungen zwischen den Konzentrationen einzelner VOCs und bestimmten verwandten physiologischen oder metabolischen Parametern zu identifizieren. Daher wird propagiert, dass mehr Anstrengungen auf die Identifizierung und exakte Quantifizierung einzelner VOCs im Atem-Exhalat gerichtet werden, die physiologisch bedeutsamer sind, wie dies am besten durch die Quantifizierung von Stickstoffmonoxid (NO) im Atem veranschaulicht wurde. Die Unterstützung für den Wert der individuellen VOC-Quantifizierung wird durch die SIFT-MS-Studien zu Atem-Wasserstoffcyanid, HCN, einem Biomarker für P. aeruginosa-Infektionen, Atem-Essigsäure als Indikator für die Versauerung der Atemwege bei Mukoviszidose-Patienten und n-Pentan als Atembiomarker für Entzündungen bei Patienten mit idiopathischer Darmerkrankung. Diese einzelnen VOCs könnten als nicht-invasive Marker für die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen verwendet werden. Der Anstieg des Atemmethanols nach der Einnahme einer bekannten Menge des Süßstoffs Aspartam zeigt eindrucksvoll, dass eine genaue Atemanalyse ein zuverlässiger Indikator für die Blutkonzentration ist [18].
DNA-Fragmente: Hinweis auf Methanol- oder Ethanol-Produktion
Bakterien in den Atemwegen von Mukoviszidose-Patienten sind genetisch in der Lage, VOCs im Atem zu produzieren. Um dies zu untersuchen, wurde der Atem von sieben Mukoviszidose-Patienten entnommen und durch GC-MS analysiert. Aus Sputumproben wurde mikrobielle DNA isoliert. Nach einer metagenomischen Sequenzierung wurden die DNA-Fragmente mit einer Referenzdatenbank mit Genen verglichen, die mit dem Metabolismus von Acetaldehyd, Ethanol und Methanol in der KEGG-Datenbank verknüpft sind [16]. Die Bakterien der Gattungen Escherichia, Lactococcus, Pseudomonas, Rothia und Streptococcus haben das genetische Potenzial, Acetaldehyd und Ethanol zu produzieren. Escherichia ist bei allen Patienten genetisch in der Lage, Ethanol zu produzieren, während bei den anderen Gattungen eine erhebliche Heterogenität zwischen den Patienten bestand. Die Ethanol-Konzentration im Atem korrelierte mit der Menge an Escherichia im Sputum (Spearman rho = 0,85, p = 0,015). Rothia zeigte das vielseitigste genetische Potenzial für Methanol-Produktion [16].
Diese VOCs können eine Kolonisierung und/oder Infektion der Atemwege vorhersagen und die Annahme untermauern, dass das Lungenmikrobiom VOCs direkt produzieren kann.
Differenzierung von Lungeninfektionserregern
In einer Proof-of-Concept-Studie untersuchten Nizio und Kollegen [19], ob eine Reihe von Mukoviszidose-assoziierten Bakterienarten (P. aeruginosa, Burkholderia cenocepacia, Haemophilus influenzae, S. maltophilia, Streptococcus pneumoniae und S. milleri) anhand ihrer flüchtigen metabolomischen Profile in vitro differenziert werden können. Headspace-Proben wurden mittels Festphasen-Mikroextraktion (SPME) gesammelt, mittels umfassender zweidimensionaler Gaschromatografie-Flugzeit-Massenspektrometrie (GC × GC-TOFMS) analysiert und mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) ausgewertet, um die Multivariat-Struktur der Daten zu bewerten. Obwohl es mit dieser Methode nicht möglich war, alle sechs Bakterien-Spezies suffizient zu differenzieren, zeigten die Ergebnisse, dass das Vorhandensein eines bestimmten Musters von VOCs für die Identifizierung von Bakterien-Spezies erforderlich ist. Es wurde festgestellt, dass das spezielle Muster von VOCs von der Bakterienwachstumsphase (z. B. logarithmisch gegenüber stationär) und den Probenlagerungsbedingungen (z. B. Kurzzeit- gegenüber Langzeitlagerung bei –18 °C) abhängt.
VOC-Muster: besser als Einzel-VOCs
Kramer und Kollegen [22] untersuchten, ob eine einfache und schnelle Erkennung von Lungeninfektionen mittels Festphasen-Mikroextraktion (SPME) von 100 ml Atem-Exhalat möglich ist. Sie entwickelten ein Analyseverfahren zum Nachweis von VOCs aus dem Headspace epithelialer Lungenzellen, die mit vier humanen Pathogenen infiziert wurden. Die Machbarkeit dieser Methode wurde in einer Ambulanz für Mukoviszidose in vivo getestet. Das Atem-Exhalat wurde durch SPME extrahiert und durch GC-MS analysiert. Die im Infektionsmodell freigesetzten VOC-Zusammensetzungen waren für alle getesteten Einzelpathogene charakteristisch. Das Atem-Exhalat von Mukoviszidose-Patienten ermöglichte eine klare Unterscheidung zu den Kontrollen anhand ihres VOC-Profils unter Verwendung multivariater Analysen. Interessanterweise unterschieden sich die wichtigsten spezifischen VOCs, die im Atem infizierter Mukoviszidose-Patienten in vivo nachgewiesen wurden, von denen, die während des bakteriellen In-vitro-Wachstums überwacht wurden. Die SPME-Extraktion von VOCs aus 100 ml menschlichem Atem ermöglichte die Unterscheidung zwischen Mukoviszidose-Patienten und gesunden Probanden.
Pseudomonas aeruginosa: chronische Infektion und VOCs im Verlauf
Chronische Lungeninfektionen mit P. aeruginosa (PA) bei Mukoviszidose-Patienten verringern die Lebensqualität erheblich und erhöhen Morbidität und Mortalität. Die Verfolgung dieser Infektionen ist für den klinischen Verlauf des Patienten und eine optimale Behandlung entscheidend. Eine Entwicklung neuartiger atembasierter Biomarker, um chronische Lungeninfektionen mit PA in situ zu beobachten, ist höchst relevant für das Management von Mukoviszidose-Patienten. Mithilfe einer umfassenden zweidimensionalen GC in Verbindung mit Flugzeit-MS (GC × GC-TOF-MS) haben Davis und Kollegen [24] die in vitro flüchtigen Metabolome („Volatilome“) von 81 PA-Isolaten charakterisiert, die von 17 Mukoviszidose-Patienten über mindestens fünf Jahre ihrer chronischen Lungeninfektionen isoliert worden waren. Die Autoren identifizierten 539 flüchtige Stoffe, die von den PA-Isolaten produziert wurden, von denen 69 flüchtige Kernbestandteile hoch konserviert waren. Jedes frühe Infektionsisolat weist ein einzigartiges Volatilom auf. Mit fortschreitender Infektion werden die Volatilome von Isolaten desselben Patienten zunehmend unähnlicher, bis zu dem Punkt, dass diese intrapatienten Isolate einander nicht ähnlicher sind als jene PA-Isolate von anderen Patienten. Sie beobachteten, dass sich die Größe und chemische Vielfalt der PA-Volatilome im Verlauf chronischer Infektionen nicht ändert. Die relative Häufigkeit von Kernkohlenwasserstoffen, Alkoholen und Aldehyden ändert sich jedoch und korreliert mit Änderungen der Phänotypen, die mit chronischen Infektionen assoziiert sind. Diese Studie demonstrierte, dass es möglich sein könnte, chronische Lungeninfektionen von P. aeruginosa durch Messung von Veränderungen des „Infektionsvolatiloms“ zu überwachen, und legt die Grundlage für die Untersuchung der Übersetzbarkeit dieses Ansatzes zur direkten Messung unter Verwendung des Atem-Exhalats von Mukoviszidose-Patienten.
Die Autoren Španěl et al. [15] führten eine nicht-invasive Atemanalyse durch, um flüchtige Biomarker für Lungen- und Atemwegsinfektionen durch P. aeruginosa (PA) bei Mukoviszidose-Patienten zu identifizieren. Sie analysierten Atem-Exhalat von 20 PA-infizierten Patienten und 38 PA-negativen Patienten unter Verwendung ausgewählter Ionenflussrohr-Massenspektrometrie (SIFT-MS). Besonderes Augenmerk wurde auf die Identifizierung und genaue Quantifizierung von 16 VOCs gelegt; sichergestellt durch die detaillierte Betrachtung ihrer im SIFT-MS-Reaktor auftretenden analytischen Ionenchemie. Wurden jeweils die Konzentrationen einer dieser VOCs isoliert betrachtet, ergab sich nur eine geringe diagnostische Sensitivität und Spezifität. Wenn jedoch eine lineare Kombination der Konzentrationen aller 16 VOCs verwendet wurde, um eine Kurve mit optimierten ROC (receiver operating characteristics) unter Verwendung eines linearen logistischen Modells zu erstellen, war die diagnostische Diskriminierung von PA-infizierten zu PA-negativen Patienten offensichtlich bezogen auf die Sensitivität (89 %) sowie Spezifität (86 %) relativ gut. Die Fläche unter der ROC-Kurve betrug 0,91. Vier Verbindungen wurden durch das lineare logistische Modell als signifikant offenbart: Malondialdehyd, Isopren, Phenol und Acetoin. Während ein solcher Metabolomics-Ansatz zur Optimierung der ROC-Kurve in der Atemanalyse weit verbreitet ist, kann er zu irreführenden Indikationen führen. Španěl und Kollegen [15] schließen daraus, dass die Ergebnisse der linearen logistischen Modellanalysen von begrenztem unmittelbarem klinischem Wert sind. Die identifizierten Verbindungen sollten eher als Anreiz für weitere unabhängige Studien mit größeren Kohorten betrachtet werden.
