Nukleinsäureamplifikationstechniken: Was darf es für Sie sein?

Assayportfolio NAT

Download Assayportfolio

Komplettsysteme Nukleinsäuretestung - Integrierte Systeme

Komplettsysteme Nukleinsäuretestung - POC-Gerät und Modulare Systeme

Download Tabellarische Übersicht über die Komplettsysteme der Nukleinsäuretestung

Nukleinsäureamplifikationstechniken – kurz NAT – werden für den gezielten Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt. Neben der prominentesten Amplifikationstechnik, der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), gibt es noch verschiedene weitere Amplifikationstechniken, die in kommerziellen Testkits Anwendung finden – zum Beispiel die isothermale Amplifikation. Die methodische Entwicklung verläuft weiterhin rasant [1].

Assayportfolio

Das Einsatzgebiet von NAT-Geräten ist breitgefächert. So finden sie ihren Einsatz unter anderem in der Infektiologie, der Onkologie und der Humangenetik. Die hier vorgestellten Hersteller bieten Testkits für die Virologie, die Bakteriologie, die Mykologie und die Parasitologie an. In der Assay-Tabelle sind sowohl Einzel- als auch Multiplextests den vorgestellten Geräten und den zugehörigen Herstellern zugeordnet. 

Systeme für Groß und Klein

Mittlerweile gibt es Systeme für jede Laborgröße und für jeden Bedarf. Eine optimale Gerätekonstellation hängt letztlich von den jeweiligen Gegebenheiten des Labors ab. Für die Entscheidungsfindung müssen unter anderem räumliche Bedingungen, die personelle Situation und die diagnostischen Fragestellungen berücksichtigt werden. In der folgenden tabellarischen Übersicht sind vier integrierte Systeme, drei modulare Systeme und ein Point-of-Care(POC)-Gerät zu finden. Alle Systeme basieren auf der PCR zur In-vitro-Amplifikation spezifischer Zielsequenzen.

Integriert oder modular?

Bei integrierten Systemen laufen alle Schritte der molekularen Diagnostik automatisiert ab, und bei den Zwischenschritten sind keine manuellen Eingriffe des Personals notwendig. Modulare NAT-Workflows können nach Belieben kombiniert werden, erfordern aber teilweise manuelle Arbeitsschritte. Sie bestehen aus getrennten Gerätschaften, die verschiedene Aufgaben wie die Probenvorbereitung, das Assay-Setup, die Amplifikation und die Detektion erfüllen.

Modulare Systeme

Aus welchen Komponenten sich ein molekularer Workflow zusammensetzt, ist je nach Hersteller unterschiedlich: Im Workflow in Spalte 2 der tabellarischen Übersicht zu den modularen Systemen kann beispielsweise eine Pipettierroboter-Workstation die automatisierte Probenaufreinigung und -vorbereitung für die Amplifikation und Detektion im Thermocycler des gleichen Herstellers übernehmen. Hierbei sind die Aufreinigungs-Workflows variabel und nicht zwingend an die Pipettierroboter-Workstation gebunden. 

Beim System in Spalte 3 können die drei genannten Geräte je nach Bedarf kombiniert werden. Ein Modul, das auf Robotiktechniken und Software-Algorithmen basiert, dient der automatisierten Probenvorbereitung und -verwaltung. Die beiden anderen Module sind für das Assay-Setup und die Amplifikation/Detektion zuständig. Da sie zudem ein unterschiedliches Assayportfolio abdecken, können hier auch verschiedene Erregergruppen nachgewiesen werden. 

Der Workflow des Herstellers in Spalte 4 besteht aus einem vollautomatischen und kompakten System zur Extraktion von DNA und RNA mithilfe von Reagenzienkartuschen sowie einem Cycler für die Amplifikation und Detektion. Beide Geräte können in Kombination einen NAT-Workflow vom gleichen Hersteller ermöglichen, sind aber auch mit Geräten anderer Hersteller kombinierbar.

Integrierte Systeme und POC-Systeme

Der gleiche Hersteller präsentiert in Spalte 3 ein integriertes System als vollautomatisierte Gesamtlösung. Dieses Tischgerät deckt den gesamten Prozess von der Nukleinsäure-Extraktion über das PCR-Setup, die PCR-Amplifikation bis hin zur automatischen Ergebnisauswertung ab.

Ein weiteres vollintegriertes System, das den gesamten Prozess innerhalb eines Tischgeräts abdeckt, ist in Spalte 2 zu finden. Beide vorgestellten Tischgeräte sind flexibel hinsichtlich der Assays und Proben. Sie unterscheiden sich aber u. a. in ihrer Größe, der Gesamtlaufzeit, der Probenkapazität sowie dem Probendurchsatz.

Spalte 1 und Spalte 4 zeigen zwei integrierte Standgeräte, die vieles gemeinam haben, die sich jedoch ebenso hinsichtlich ihrer Probenkapazität, des Probendurchsatzes und einigen anderen individuellen Eigenschaften unterscheiden. Das Gerät in Spalte 1 kann sowohl voll- als auch teilintegrierte Läufe fahren, was es flexibel macht. Darüber hinaus ist eine Retestung aus Eluat möglich. Das Gerät in Spalte 4 nimmt als Standgerät nur eine kleine Fläche ein und setzt sich aus unabhängigen modularen Komponenten zusammen. Es ermöglicht die Bearbeitung von bis zu 15 Targets pro Probe.

Neben all den genannten Geräteplattformen für das Zentrallabor wird in Spalte 1 ein POC-Gerät für den patientennahen Gebrauch vorgestellt. Das kompakte Dasein von POC-Geräten begründet sich darin, dass sie nur zwei Bauteile benötigen: Testspezifische Kartuschen, die bereits alle notwendigen Reagenzien enthalten, werden mit der entnommenen Probe beladen und für den weiteren Reaktionsablauf einem Steuergerät zugeführt, das die Amplifikationsbedingungen und die Detektion ermöglicht.

Kontrollmechanismen

Die Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (Rili-BÄK) dient der Sicherung der Qualität laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen und der Risikominimierung für Patient:innen und Anwendende. Sie legt dafür grundsätzliche Anforderungen an Untersuchungen in der Medizin fest. Darunter fällt zum Beispiel die Minimierung von Einflussgrößen und Störfaktoren [2]. 

Kontrollmechanismen wie eine Gesamtprozesskontrolle, unabhängige externe Qualitätskontrollen und auch Ringversuche tragen zur Methodensicherheit bei. Außerdem werden Kontaminationskontrollen oder verschiedene Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung eingesetzt, um nichtvalide NAT-Ergebnisse durch Kreuzkontaminationen oder eingeschleppte Fremdnukleinsäuren zu vermeiden. 

Eine Schutzmaßnahme stellt die Trennung der Sample Preparation, des Assay-Setups und der eigentlichen Amplifikation dar. Früher mussten die einzelnen Schritte daher immer räumlich getrennt durchgeführt werden. Mittlerweile ist es durch Mikrofluidik und andere Miniaturisierungstechniken möglich, eine Trennung dieser Schritte auch auf kleinstem Bereich zu ermöglichen (z. B. durch die verschiedenen Kompartimente einer kleinen Kartusche).

Andere Maßnahmen sind Einwegmaterialien, vorkonfektionierte Reagenzien, gestopfte Pipettenspitzen zur Vermeidung von Aerosolen, die zusätzliche Überwachung der Aerosole durch MAD (Monitored Air Displacement) (Spalte 4), der Einsatz von verschiedenen Kontrollen usw. (Tabellenabfragen „Proben-/Kontaminationskontrolle“ und „interne Kontrollen“). Erwähnenswert ist auch der Gebrauch von Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) oder Uracil-N-Glycosylase (UNG; zur UDG-Familie gehörig) wie bei den Geräten aus Spalte 3 und 4 und Spalte 4. Als Bestandteil eines Basenexzisionsreparatursystems kann UDG vor dem Amplifikationsstart zur Entfernung eventueller Kreuzkontaminationen der Probe eingesetzt werden [3].