TSH-Rezeptor-Antikörper -Methodenvergleich und klinischer Nutzen

Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen sind mit der Anwesenheit von Antikörpern gegen Schilddrüsenantigene wie der Thyreoperoxidase, des Thyreoglobulin und des Thyroidea-stimulierenden Hormon-Rezeptors assoziiert. Diese Antikörper können entweder mithilfe eines kompetitiven Bindungs-Immunoassays oder eines zellbasierten Bioassays nachgewiesen werden.

Schlüsselwörter: Schlüsselwörter: Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, TSH-Rezeptor-Antikörper, stimulierende TSH-Rezeptor- Antikörper, blockierende TSH-Rezeptor-Antikörper, Biomarker, Luciferase-Bioassays, Bindungs-Immunoassays

Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen (AISE) repräsentieren eine komplexe Gruppe von Erkrankungen mit verschiedenen klinischen Manifestationen einschließlich der Hyperthyreose, der Hypothyreose und des Kropfes. Diese Erkrankungen sind mit der Anwesenheit von Autoantikörpern (Ak) gegen mehrere Schilddrüsenantigene, wie der Thyreoperoxidase (TPO), dem Thyreo­globulin (Tg), und des Thyreo­idea-stimulierenden Hormon-Rezeptors (TSHR), assoziiert. Anti-TPO-Ak und anti-Tg-Ak werden häufig in Patienten mit AISE detektiert – in erster Linie sind sie primäre Marker des zugrunde liegenden Zell- und Zytokin-vermittelten Destruktionsprozesses. Im Gegensatz dazu sind die TSHR-Ak funktionell von Bedeutung und weisen entweder stimulierende, blockierende oder neutrale Eigenschaften auf, die an unterschiedliche Epitope des TSHR binden [1–3]. Stimulierende TSHR-Ak (sTSHR-Ak) wirken als TSH-Agonisten, indem sie an den TSHR der Thyreozyten binden und eine Hyperthyreose induzieren [4]. In der Schilddrüse führt die Stimulation des TSHR zur Aktivierung der Adenylatzyklase (AZ), wodurch intrazellulär der Botenstoff zyklisches 3‘, 5‘-Adenosinmonophosphat (cAMP) akkumuliert wird. Daraus resultierend wird eine vermehrte Synthese und Sekretion der Schilddrüsenhormone angeregt. Die Konzentrationen von freiem Trijodthyronin (T3) und freiem Thyroxin (T4) steigen an und das TSH wird supprimiert. Bei AISE handelt es sich um systemische Autoimmunerkrankungen mit sowohl thyreoidalen als auch extrathyreoidalen Manifestationen. Bei etwa 40–60 % der Patienten mit Morbus Basedow (MB) tritt eine endokrine Orbitopathie (EO) während oder nach der Hyperthyreose auf. In der Orbita führt die Bindung der sTSHR-Ak an den TSHR zu einer zunehmenden Fibrosierung und verursacht dadurch ein retrobulbäres Druckgefühl und den Exophthalmus. Die klinische Aktivität (Clinical Activity Score, CAS) und der Schweregrad (NOSPECS) der EO bei Kindern und Erwachsenen korrelieren sehr gut mit den gemessenen sTSHR-Ak-Werten im Luciferase-Bio­assay [5–8]. Blockierende TSHR-Ak (bTSHR-Ak) üben eine inhibierende Wirkung aus, indem sie mit TSH um die Bindung an den TSHR konkurrieren. bTSHR-Ak führen zu einer Hypothyreose bei Patienten mit einer Hashimoto-Thyreoiditis (HT). Patienten mit HT können ebenfalls eine schilddrüsenassoziierte Orbitopathie entwickeln. Die Prävalenz von sTSHR-Ak bei Patienten mit HT und schilddrüsenassoziierter Orbitopathie beträgt 6 % [9]. Des Weiteren können die funktionellen TSHR-Ak transplazentar übertragen werden und fetale bzw. neonatale Schilddrüsenerkrankungen auslösen [10]. Die Detektion von funktionellen TSHR-Ak ist somit für die Diagnose und Prognose bei AISE von erheblicher klinischer Bedeutung. Bei den stimulierenden und blockierenden TSHR-Ak handelt es sich um sensitive, spezifische und reproduzierbare Biomarker. Neutrale TSHR-Ak wirken weder stimulierend noch blockierend. Für neutrale TSHR-Ak gibt es bislang keine labordiagnostisch anwendbaren Nachweismethoden. Sie werden auch als „Cleavage“-Ak bezeichnet, da sie die Apoptose der Thyreozyten über reaktive Sauerstoffspezies induzieren [11].

TSH-Rezeptor

Der TSHR stellt das primäre Antigen bei autoimmun-bedingten Schilddrüsen­erkrankungen dar und ist wichtig für die Funktion und das Wachstum von Thyreozyten. Der TSHR wird nicht nur in der Schilddrüse exprimiert, sondern auch in orbitalen Fibroblasten und Adipozyten. Der TSHR ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor und löst über Guanosintriphosphat(GTP)-bindende Proteine die Aktivierung von zellulären Signalkaskaden aus. Dies geschieht überwiegend über den cAMP-Signalweg. Der TSHR weist eine große Amino(N)-terminale extrazelluläre Domäne auf, die von wichtiger Bedeutung für die Bindung des Liganden ist. Hier binden sowohl der physiologische Ligand TSH als auch die TSHR-Ak. Die extrazelluläre Domäne wird als Alpha- oder A-Untereinheit und die Transmembran-Domäne mit dem Carboxy(C)-terminalen Ende als Beta- oder B-Untereinheit bezeichnet.

Nomenklatur
In der Literatur werden unterschiedliche Begriffe für die TSHR-Ak verwendet [12]. TSHR-Ak werden oft auch „TRAb“ (TSH-receptor antibodies) genannt, was sich jedoch nicht auf einen spezifischen Antikörpertyp bezieht. Dieser Ausdruck wird gewöhnlich für die kompetitiven Bindungs-Immunoassays angewandt, da sie lediglich die gesamte Anti-TSHR-Bindungsaktivität detektieren. Zellbasierte Bioassays messen entweder stimulierende oder blockierende TSHR-Ak. Stimulierende TSHR-Ak werden „TSHR stimulating antibodies (TSAb)“ oder auch „TSHR stimulating immuno­globulins (TSI)“ genannt. Hingegen werden blockierende TSHR-Ak in Bioassays als „TSHR blocking antibodies (TBAb)“ oder „TSHR blocking immunoglobulins (TBI)“ aufgeführt. Es gibt verschiedene Indikatio­nen zur Messung von TSHR-Ak, die in Tab. 1 aufgelistet sind.


Klinischer ZustandKlinischer Nutzen
Morbus BasedowBestätigung der Diagnose
HyperthyreoseDifferenzialdiagnose
Radiojodbehandlung beiKontrolle/Überwachung der Verstärkung der
ThyreotoxikoseImmunreaktion („Immunverstärkung“) und Anstieg der TSHR-Ak
ThyreostatikaKontrolle/Überwachung des Autoantikörper-Status bezüglich der Dauer der thyreostatischen Behandlung
Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen während der SchwangerschaftRisikobestimmung für den Fötus
Postpartale SchilddrüsenerkrankungenKontrolle/Überwachung des Antikörper- Rückschlags und der Antikörper-induzierten Schilddrüsendysfunktion
Neonatale SchilddrüsendysfunktionenBestimmung der funktionellen TSHR-Ak, um das Risiko abzuschätzen
Hashimoto Thyreoiditis mitVorhersage der Orbitabeteiligung anhand
extrathyreoidalen Manifestationenstimulierender TSHR-Ak
Autoimmun-induzierte HypothyreoseVerdacht auf blockierende TSHR-Ak
Euthyreote OrbitopathieDiagnose Morbus Basedow
Down SyndromDifferenzialdiagnose von einer autoimmun-induzierten Hyper- oder Hypothyreose

Nachweismethoden

Generell können TSHR-Ak mit zwei Typen von Messmethoden nachgewiesen werden. Entweder mit einem sogenannten kompetitiven Bindungs-Immunoassay oder mithilfe eines zellbasierten Bio­assays [13]. In der klinischen Routine werden Bindungs-Immunoassays eingesetzt, die auf dem Prinzip der Verdrängung eines Tracers, beispielsweise von radioaktiv-markiertem bovinem TSH oder eines human monoklonalen stimulierenden TSHR-Ak M22 durch vorhandene TSHR-Ak im Patientenserum basieren. Die gemessenen TSHR-Ak werden im Bindungs-Immunoassay als TBII (TSHR binding inhibitory immunoglobulins) bezeichnet. Der Nachteil des Bindungs-Immunoassays ist, dass nicht differenziert werden kann, ob es sich um funktionsstimulierende oder -blockierende TSHR-Ak handelt [14, 15]. Die Angaben eines Herstellers, dass der Brücken-Immunoassay spezifisch für die Entdeckung von TSH-Rezeptor-stimulierenden Antikörpern ist, konnte durch zahlreiche kontrollierte Studien nicht bestätigt werden [2, 8, 13, 14, 15]. Die Unterscheidung würde aber wichtige Indizien und Hinweise über den weiteren Krankheitsverlauf bezüglich der Schwere und der Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs geben. Die Klonierung und Expression des humanen TSHR ermöglichte die Entwicklung von zellbasierten Bioassays. Heutzutage existiert jedoch keine einzige Zelllinie, die spezifisch nur stimulierende oder blockierende TSHR-Ak detektiert [2]. Die Differenzierung dieser funktionellen TSHR-Ak in in-vitro-zellbasierten Bio­assays wird aufgrund des Arbeitsaufwandes und des benötigten erfahrenen Laborpersonals bislang nur in wenigen speziellen Laboratorien durchgeführt, während die Bestimmung von TSHR-Ak in kommerziellen Bindungs-Immunoassays in der Routinediagnostik bereits etabliert ist. Neue Entwicklungen mit rekombinanten Rezeptoren und einem induzierbaren Luciferase-Gen könnten das ändern und den Bioassay routinetauglich machen.

Luciferase-Bioassays

Grundlage der beiden Reportergen-Bioassays für stimulierende und blockierende TSHR-Ak sind Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, die sowohl eine chimäre Form des humanen TSHR (MC4, mutant chimeric 4) exprimieren als auch das cAMP-induzierbare Luciferase-Gen. In dem MC4-Konstrukt wurden die Aminosäuren (AS) 262–368 des humanen TSHR entfernt und mit den AS 262–334 des Ratten-luteinisierenden Hormon-Choriongonadotropin (LH-CG)-Rezeptors ersetzt [16]. Die Weiterleitung des TSHR-Signals wird überwiegend durch die Aktivierung der AZ vermittelt, was zu einem intrazellulären Anstieg von cAMP führt. Die AZ setzt Adenosintriphosphat (ATP) zu cAMP um. Nach ihrer Aktivierung wandert die katalytisch aktive Proteinkinase (PK) A in den Zellkern ein und aktiviert durch Phosphorylierung den Transkriptionsfaktor CREB (cAMP responsive element binding protein). Das aktivierte CREB bindet an die CRE(cAMP responsive element)-Bindungsstellen im Promotor und bewirkt die Transkription des Luciferase-Gens. Der Bioassay für funktionsstimulierende TSHR-Ak wurde bereits mit internationalem Referenzmaterial (08/204, National Institute for Biological Standards and Control) für stimulierende TSHR-Ak standardisiert [17]. Der internationale Standard (IS 08/204) beinhaltet den human-monoklonalen stimulierenden TSHR-Ak M22. Gegenwärtig werden die Ergebnisse im Bioassay für stimulierende TSHR-Ak noch als Prozentverhältnis des Probensignals zu einer Referenzkontrolle (percentage of specimen-to-reference ratio, SRR %) berechnet. Die Ergebnisse der Konvertierung in internationale Einheiten pro Liter bieten jedoch die Perspektive zur Standardisierung von sTSHR-Ak zwischen verschiedenen Laboratorien und ermöglichen einen präzisen Vergleich von sTSHR-Ak-Studien. Im Bioassay für blockierende TSHR-Ak wird bei der Verdünnung der zu testenden Serumproben zusätzlich bovines TSH hinzugefügt [18]. Die durch TSH stimulierte Luciferase wird durch die vorhandenen bTSHR-Ak blockiert und die Luciferase-Aktivität wird proportional durch die blockierende Aktivität in der Serumprobe inhibiert. Die Ergebnisse in dem Bioassay für blockierende TSHR-Ak werden als Prozent-Inhibition berechnet. Der Vorteil beider zellbasierter Bioassays ist, dass die Testergebnisse in weniger als 24 Stunden vorliegen. Sowohl der Bioassay für stimulierende TSHR-Ak als auch der Bio­assay für blockierende TSHR-Ak weisen eine exzellente analytische Performance sowie ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit auf [16–20].



 

 Detektionsprinzip Cut-offLoD1VorteileNachteile
Kompetitiver Bindungs-Immunoassay; Gesamt-TSHR-Ak
ELISA-Assay
Klassischer
ELISA
- Kompetitiver Bindungs-Immunoassay, TBII
- TSHR-Ak konkurrieren mit M22-monoklonalen Anti­körper (MAk)-HRP (horse radish peroxidase) um die Bindung an den TSHR (Spezies ist undefiniert)
Chromogenes Substrat ( 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, TMB)
- Messung: Absorption bei 450 nm
1 IU/l0,06 IU/l- Internationale Standardisierung- Keine Differenzierung funktioneller TSHR-Ak
- Nicht automatisiert
- TSHR-Ak reflektieren Gesamt-TSHR-Ak
Automatisierte Assays
Elektrochemilumineszenzassay- Kompetitiver Bindungs-Immunoassay, TBII
- TSHR-Ak konkurrieren mit ruthenyliertem
M22-MAk um die Bindung an den porcinen TSHR
- Biotinylierter Maus-Anti-TSHR-MAk 4E31,
Streptavidin-beschichtete Mikropartikel
- Messung: Elektrochemilumineszenz
1,75 IU/l0,3 IU/l- Internationale Standardisierung
- Automatisiert
- Keine Differenzierung funktioneller TSHR-Ak
- TSHR-Ak reflektieren Gesamt-TSHR-Ak
TRACE
(Time-resolved amplified
cryptate
emission)
Technologieassay
- Kompetitiver Bindungs-Immunoassay, TBII
- TSHR-Ak bindet an den humanen TSHR
- Humaner TSHR im Komplex mit einem Maus-MAk, welcher mit einem fluoreszierenden Akzeptor gekoppelt ist
- Der Komplex aus 22A und TSHR liegt in Kombination mit einem humanen TSHR-stimulierenden monoklonalen Ak mAB9 vor, der in Konkurrenz zur Bindung der TSHR-Ak steht
- Energietransfer von einem Donator (Kryptat) auf einen Akzeptor (XL)
- Messung: Zeitverzögerte Fluoreszenz
1,8 IU/l0,27 IU/l- Internationale Standardisierung
- Automatisiert
- Keine Differenzierung funktioneller TSHR-Ak
- TSHR-Ak reflektieren Gesamt-TSHR-Ak
Brücken-
Bindungs-
Immunoassay
- Brücken-Bindungs-Immunoassay
- Verwendung eines Paares rekombinanter humaner TSHR (MC4)-Konstrukte in einem überbrückenden Immunoassay-Test
- Bindungsrezeptor ist auf einem Polystyrol-Kügelchen immobilisiert
- TSHR-Ak werden über einen Arm an den
Bindungsrezeptor gebunden
- Komplexierte TSHR-Ak binden über den zweiten Arm an den Signalrezeptor und bilden eine Brücke
- Messung: Chemilumineszenz
0,55 IU/l0,06 IU/l- Internationale Standardisierung
- Automatisiert
- Keine Differenzierung funktioneller TSHR-Ak
- TSHR-Ak reflektieren Gesamt-TSHR-Ak
Bioassays
Stimulierender TSHR-Ak-Assay - Von der FDA (Food and Drug Administration) zugelassener Bioassay
- Misst die Fähigkeit von stimulierenden TSHR-Ak, die TSHR-Signalübertragung zu induzieren
- CHO-Zellen exprimieren eine chimäre Form des humanen TSHR (MC4)
- Luciferase-Gen ist unter Kontrolle des cAMP-abhängigen Promotors
- Die Luciferase-Aktivität ist proportional zur Schilddrüsen-stimulierenden Aktivität der Anti-TSH-R-Ak in der Serumprobe
- Messung: Lumineszenz
140 % SRR289 % SRR2- Differenzierung der funktionellen TSHR-Ak
- Messung der stimulierenden TSHR-Ak (TSAb)
- Misst Nettosumme der funktionalen Aktivität
Keine IgG-Aufreinigung notwendig
- Minimale Handhabung mit den Zellen
- Höhere analytische Sensitivität als bei einem Bindungs-Immunoassay
- Keine Standardisierung
- Nicht automatisiert
- Erfahrenes Laborpersonal wird benötigt
Blockierender TSHR-Ak-Assay - CE-gekennzeichneter zellbasierter Bioassay
- Die Blockierungsaktivität ist als prozentuale
Hemmung der Luciferase-Expression im Verhältnis zur Induktion mit Rinder-TSH alleine definiert
- CHO-Zellen exprimieren eine chimäre Form des humanen TSHR (MC4)
- Luciferase-Gen ist unter Kontrolle des
cAMP-abhängigen Promotors
- TSH-stimulierte Luciferase wird durch blockierende TSHR-Ak und die Luciferase Aktivität wird proportional zur Blockierung der Blockierungsaktivität in der Serumprobe gehemmt
- Messung: Lumineszenz
34%
Inhibition
22%
Inhibition
- Differenzierung der funktionellen TSHR-Ak
- Messung der blockierenden TSHR-Ak (TBAb)
- Misst die Nettosumme der funktionalen Aktivität
- Keine IgG-Aufreinigung notwendig
- Minimale Handhabung mit den Zellen
- Keine Standardisierung
- Nicht automatisiert
- Erfahrenes Laborpersonal wird benötigt

 

 

 

 

 

Vorteile der Bestimmung von sTSHR-Ak und bTSHR-Ak

  • Differenzierung der funktionellen TSHR-Ak mittels In-vitro-Zellkultur­assays
  • Geringes Probenvolumen (Serum)
  • Kurze Untersuchungsdauer
  • Höhere analytische Sensitivität im Vergleich zu Bindungs-Immunoassays
  • Frühzeitige Erkennung eines erhöhten Risikos für eine Hyper- oder Hypothyreose
  • Risikobewertung während der Schwangerschaft bei Patientinnen mit Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse
  • Therapie-Monitoring/Verlaufskontrolle bei Kindern und Erwachsenen

Ausblick

Fortschritte in der Protein- und Zellbio­technologie haben die Entwicklung verbesserter Bioassays zur Messung der funktionellen TSHR-Ak ermöglicht. Die weit verbreitete Ansicht, dass funktionelle Bioassays mühselige und zeitaufwendige Verfahren sind, die für die Routinediagnostik nicht geeignet sind, ist nicht mehr gültig. Kürzlich entwickelte Bioassays zeigen die erforderliche klinische Sensitivität und hohe Spezifität bei robuster Leistung. Die Einführung der Bioassays in die Routinediagnostik erfordert einen klaren Nachweis des klinischen Mehrwerts und der Kostenwirksamkeit im Vergleich zu den bestehenden Bindungs-Immunoassays. Prospektive Studien zur Bestimmung der sTSHR-Ak-Titer zum Studienstart als auch in regelmäßigen Zeitintervallen während der Behandlung werden durchgeführt, um festzustellen, ob der Biomarker „sTSHR-Ak“ zur Optimierung des Ansprechens der Patienten auf die Therapie und zur Vorhersage eines Rezidivs oder einer Remission von Nutzen ist. Darüber hinaus wird derzeit der Einfluss von funktionellen TSHR-Ak-Bioassays auf die Reduzierung des Bedarfs an Schilddrüsen-Follow-up-Untersuchungen und teuren Bildgebungstechniken untersucht. Weitere Studien zur Prävalenz und klinischen Bedeutung von sTSHR-Ak und bTSHR-Ak bei Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis, pädiatrischen Patienten und schwangeren Frauen sind erforderlich, um Ärzten eine bessere Interpretation ihrer Rolle bei verschiedenen klinischen Darstellungen von AISE zu ermöglichen. 

Die Universitätsmedizin Mainz hat forschungs­assoziierte Drittmittel von der Firma Quidel, USA, erhalten. Prof. Kahaly ist wissenschaftlicher Berater von Quidel.

 

Autoren
Dr. rer. nat. Tanja Diana
Prof. Dr. med. George J. Kahaly
Universitätsmedizin Mainz
I. Medizinische Klinik und Poliklinik Molekulares Schilddrüsenlabor Laborleiter Prof. George J. Kahaly
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