Molekularpathologische Untersuchungen in zirkulierender Tumor-DNA am Beispiel der EGFR-p.T790M -Mutation beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom

Die Analyse von zirkulierender freier Tumor-DNA aus dem Blut stellt eine wertvolle Ergänzung zum Mutationsnachweis aus Tumorgewebe (Biopsie, Resektat) dar, und zwar insbesondere dann, wenn die Gewebeentnahme schwierig oder für den Patienten zu belastend ist. Als sog. „Liquid Biopsy“ gewinnt diese noch relativ junge Technik in der onkologischen Diagnostik zunehmend an Bedeutung – aktuell beispielsweise zum Nachweis der Resistenz-vermittelnden EGFR-p.T790M-Mutation bei Progression eines nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) unter der Behandlung mit einem konventionellen EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor (EGFR-TKI) der ersten oder zweiten Generation. Der Nachweis dieser Mutation ist für die Verordnung des Drittgenerations-Tyrosinkinase-Inhibitors Osimertinib in der Zweitlinientherapie vorgeschrieben und wurde als erste und bisher einzige Liquid-Biopsy-Untersuchung in den EBM-Vergütungskatalog aufgenommen (Ziffer 19460).

In der vorliegenden Arbeit werden die einzelnen Schritte der Liquid Biopsy am Beispiel dieser EGFR-p.T790M-Mutation detailliert beschrieben und methodenkritisch bewertet. Ein besonderer Fokus liegt auf der korrekten Probengewinnung einschließlich Transport ins Labor (Präanalytik). Weitere Abschnitte befassen sich mit der Auswahl des geeignetsten Nachweisverfahrens von der klassischen qPCR bis zum Next Generation Sequencing inkl. Methodenvalidierung (Analytik) sowie der Gestaltung des Befundberichts (Postanalytik).

Die hier beispielhaft dargestellten Techniken sind auch auf andere Mutationen, Indikationen und Körperflüssigkeiten anwendbar. Es ist zu erwarten, dass die Liquid Biopsy in Zukunft nicht nur für Einzelanalysen, sondern auch für ganze Mutations-Profile eingesetzt wird.

Dieser Beitrag gibt die Ergebnisse eines Expertenworkshops wieder, der am 9. und 10. März 2018 in Frankfurt am Main stattfand. 

Eine ausführliche Version ist in Buchform erschienen [1].

Schlüsselwörter: Liquid Biopsy, NSCLC, EGFR-p.T790M-Mutation, Osimertinib

In den letzten 20 Jahren wurden zahlreiche onkologische Treibermutationen identifiziert, die ursächlich für das Tumorwachstum verantwortlich sind. Ihr Nachweis hat die therapeutischen Möglichkeiten in der Onkologie revolutioniert, denn vielfach stellen die mutierten Genprodukte Zielstrukturen für neue Medikamente dar. So war der Nachweis, dass der Tyrosinkinase-Inhibitor Gefitinib nur gegen Tumoren mit aktivierenden Mutationen im Rezeptorgen für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) wirksam ist, der Beginn der personalisierten Therapie beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC).

Trotz beeindruckender Erfolge dieser Behandlungsstrategie ist eine dauerhafte Heilung beim fortgeschrittenen NSCLC bislang allerdings noch nicht möglich, denn gegen die Wirkung solcher Inhibitoren entwickeln Krebszellen früher oder später Resistenzen. Sie entstehen durch neue Mutationen in den Tumorzellen oder durch Selektion von primär resistenten Subklonen. Um solch eine Resistenzentwicklung rechtzeitig zu erkennen und das Therapieschema gegebenenfalls anpassen zu können, sind molekularpathologische Kontrollen erforderlich. 

Diese erfolgen idealerweise direkt aus dem Tumorgewebe (Resektat, Biopsie). Da die Entnahme aus der Lunge für den Patienten eine erhebliche Belastung darstellt, rückte als Alternative in den letzten Jahren die sogenannte „Liquid Biopsy“ immer mehr in den Vordergrund – also die molekulargenetische Untersuchung von Tumor-DNA im Blut (circulating tumor DNA, ctDNA). 

Basierend auf der Beobachtung, dass Körperzellen ganz allgemein und Tumorzellen im Speziellen Nukleinsäuren in die Blutbahn abgeben (siehe Abb. 1), können damit therapierelevante genomische Abschnitte analysiert werden, die sowohl aus dem Primärtumor als auch aus etwaigen Metastasen stammen.

EGFR-p.T790M-Mutation beim NSCLC

In Deutschland findet man bei etwa 10% aller nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome aktivierende Mutationen des EGFR-Gens [2], die mit konventionellen EGFR-TKI der ersten oder zweiten Generation (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib) erfolgreich behandelt werden können [3]. Stellt sich im Laufe der Behandlung eine Resistenz gegenüber einem derartigen EGFR-TKI ein, so ist diese in etwa der Hälfte der Fälle durch eine spezielle zusätzliche Punktmutation bedingt. Sie trägt die Bezeichnung NM_005228.4(EGFR): c.2369C>T (kurz p.T790M-Mutation). Dabei verhindert der Austausch einer einzigen Aminosäure im EGFR-Proteinmolekül (T = Threonin durch M = Methionin) die Hemmung des aktivierten EGFR-Proteins, sodass die initiale Therapie unwirksam wird. 

Für die betroffenen Patienten steht bislang nur Osimertinib als zugelassener Drittgenerations-EGFR-TKI zur Verfügung. Die Folgebehandlung mit diesem Wirkstoff erfordert zwingend den Nachweis dieser p.T790M-Mutation im EGFR-Gen – eine diagnostische Strategie, die im Englischen als „Companion Diagnostics“ (CDx, deutsch: Begleit­diagnostik) bezeichnet wird. 

Aus den oben genannten Gründen wurde für solche Fälle neben der Gewebebiopsie auch die Liquid Biopsy zugelassen, und der blutplasmabasierte p.T790M-Test erhielt damit als erstes und bislang einziges Verfahren eine eigene EBM-Ziffer (19460) für die kassenärztliche Abrechnung einer Liquid Biopsy. 

Der vorliegende Beitrag erläutert die molekularpathologische Untersuchung von zirkulierender Tumor-DNA im Blut am Beispiel dieser EGFR-p.T790M-Mutation, doch sinngemäß können die hier diskutierten Erkenntnisse und praktischen Hinweise auch auf andere Biomarker und Körperflüssigkeiten übertragen werden. Entscheidend für ein korrektes und aussagekräftiges Ergebnis sind vor allem 

• die Einhaltung präanalytischer Vorgaben bei Probengewinnung und Versand, 

• die Auswahl eines Analysenverfahrens mit ausreichender Sensitivität, 

• die postanalytische Validierung und Befundung.

Es ist zu erwarten, dass die Bedeutung der Liquid Biopsy für die Primärdiagnostik und Verlaufskontrolle von schwer zugänglichen Tumoren in den nächsten Jahren weiter zunehmen wird – unbeschadet der Tatsache, dass Osimertinib dank einer Zulassungserweiterung im Juni 2018 inzwischen auch ohne EGFR-p.T790M-Nachweis beim lokal fortgeschrittenen oder metastasierten NSCLC in der Erstlinien­therapie eingesetzt werden darf, wenn eine aktivierende EGFR-Mutation vorliegt [4]. Die Vielzahl der Biomarker, die heute für die molekulare Charakterisierung, Stadieneinteilung und Prognoseabschätzung von Tumoren zur Verfügung steht, spricht dafür, dass in Zukunft anstelle einzelner Marker zunehmend größere Markerpanels analysiert werden („Liquid Profiling“). Auch dieser Aspekt wird im Abschnitt „Analytik“ beleuchtet

Freisetzung von ctDNA

Die Existenz freier Nukleinsäuren im Blut (zellfreie DNA – cfDNA) ist bereits seit 70 Jahren bekannt [5], und seit den 1990er-Jahren weiß man, dass vor allem auch maligne Tumoren DNA in die Blutbahn abgeben. Diese Freisetzung erfolgt durch einen als „Shedding“ bezeichneten Prozess, bei dem Nukleinsäuren (DNA  und RNA) durch Apoptose oder Nekrose in die Zirkulation gelangen. Auch ganze zirkulierende Tumorzellen (CTCs) lassen sich – in meist geringer Zahl – im Blut von Krebspatienten nachweisen, und werden als Marker der Metastasierung zur Prognoseeinschätzung verwendet [6]. Da Nukleinsäuren auch aus normalen Körperzellen freigesetzt werden können (beispielsweise bei körperlicher Aktivität aus Leukozyten), macht die ctDNA in der Regel einen nur sehr kleinen Anteil an der gesamten cfDNA aus. 

Dies stellt eine besondere Herausforderung an die Sensitivität der eingesetzten Nachweisverfahren wie auch der Abnahme- und Transportbedingungen dar. Für die Liquid Biopsy wird die Detektion einer einzigen Mutation unter 100 (1%) oder sogar 1.000 Wildtyp­molekülen (0,1%) gefordert. In Abb. 2 sind typische Sensitivitäten älterer und moderner molekulardiagnostischer Verfahren dargestellt. 

Präanalytik

Die meisten labordiagnostischen Fehler entstehen außerhalb des Labors, bevor die eigentliche Analytik begonnen hat [7]. Sie reichen von der Patientenverwechslung über falsche Abnahmebedingungen und -röhrchen bis zum unsachgemäßen Transport. Deshalb ist auf Seiten des Einsenders auf strikte Einhaltung entsprechender Leitlinien [8] zu achten. Für die Liquid Biopsy bei Tumor­patienten gelten folgende Empfehlungen:

• Hoher Unterdruck und langes Stauen oder Pumpen aktivieren die Freisetzung von zellulärer DNA (genomischer DNA, kurz gDNA) aus Leukozyten. Diese verdünnt die Tumor-DNA und erschwert somit den Mutationsnachweis.

• Ähnliche Aktivierungseffekte erhält man auch durch Teilgerinnung des Blutes (falsches Röhrchen, unzureichende Mischung) sowie durch Verwendung zu dünner Nadeln. Empfohlen werden 21G-Kanülen (Durchmesser 0,8 mm, Farbcode: grün).

• Unerwünschte Konzentrations- bzw. Verdünnungseffekte entstehen durch zu langes Stauen bzw. Verunreinigung der Probe mit Infusionsflüssigkeit (Abnahme aus dem kontralateralen Arm empfohlen).

Für die Aufnahme und den Transport von Blut zur Analyse von zirkulierender freier DNA (cfDNA) gibt es verschiedene Spezialröhrchen, deren Charakteristika in Tab. 1 zusammengefasst sind. Sie enthalten Zusätze, die sowohl die Blutgerinnung hemmen als auch die cfDNA und die Leukozyten stabilisieren. Dadurch wird der Anteil der Tumor-DNA möglichst hoch, und derjenige der gDNA gering gehalten. 

Aus organisatorischer Sicht bereiten EDTA-Röhrchen die wenigsten Probleme, da sie in der klinischen Routine zum Beispiel für Blutbilder ohnehin weit verbreitet sind. Sie haben allerdings den Nachteil, dass bereits nach zwei Stunden eine Kontamination mit gDNA aus Leukozyten erfolgt. Deshalb können diese Röhrchen nur zum Einsatz kommen, wenn die Analytik sofort nach der Entnahme im eigenen Haus durchgeführt wird. Es ist empfehlenswert, die Probe schon bei der Versendung ins Labor telefonisch anzumelden, um die rechtzeitige Einspeisung in den Arbeitsprozess zu garantieren. 

In allen anderen Fällen sind Röhrchen zu verwenden, die speziell für molekulardiagnostische Analysen hergestellt wurden. Sie unterscheiden sich hinsichtlich Stabilität der cfDNA und Haltbarkeit, sind jedoch unter Berücksichtigung der Transport- und Aufbewahrungszeiten grundsätzlich alle für Liquid-Biopsy-Analysen geeignet. Die Röhrchen dürfen nicht eingefroren und nicht geschüttelt werden, da dies zur Freisetzung von gDNA führt; zum Mischen werden sie sofort nach der Blutabnahme vorsichtig geschwenkt. Probenröhrchen und Transportgefäße können auf Anfrage vom Labor zur Verfügung gestellt werden. Bei Versand sind sie mit dem Aufkleber UN3373 für infektiöse biologische Materialien zu versehen.

Analytik

Die Analytik besteht aus drei aufeinanderfolgenden Schritten (Abb. 3): Aus der Vollblutprobe werden die Zellen durch differenzielle Zentrifugation abgetrennt, danach wird aus dem Plasmaüberstand die zellfreie DNA isoliert, und schließlich erfolgt der Mutationsnachweis mit einem molekularbiologischen Verfahren (PCR, Sequenzierung). Details zur technischen Durchführung finden sich in Ref. [1].  

Die Abtrennung von korpuskulären Blutbestandteilen erfolgt zunächst in einer Laborzentrifuge, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation bei höherer g-Zahl (z. B. 16.000 x g, Mikrozentrifuge). Anschließend kann das Plasma in LoBind-Tubes bei -80 °C aufbewahrt werden.

Für die DNA-Extraktion kommen heute meist magnetische Beads oder Silikasäulen zum Einsatz. Je nach Durchsatz können die Verfahren manuell oder automatisiert durchgeführt werden. Daran schließt sich eine Qualitätsprüfung der isolierten DNA an (siehe Tab. 2).

Für den eigentlichen Mutationsnachweis stehen unterschiedlich sensitive Methoden zur Verfügung (Abb. 2). Bei der klassischen qPCR kann mit relativ geringem apparativem und personellem Aufwand jeweils eine (bekannte) Mutation – z. B. p.T790M – nachgewiesen werden. Aufwendiger, dafür aber um ein bis zwei Größenordnungen empfindlicher, ist die digitale PCR (ddPCR = digital droplet PCR), bei der einzelne DNA-Moleküle in Nanotröpfchen amplifiziert werden. 

Die DNA-Sequenzierung entdeckt im Gegensatz zur PCR je nach Methode und Testkit alle im untersuchten Genombereich auftretenden Mutationen – gegebenenfalls auch solche, nach denen nicht gesucht wurde. Das sog. Next Generation Sequencing (NGS) ist das Zeit- und Resourcen-intensivste der hier aufgeführten Verfahren: Ein Analysengang benötigt inklusive bioinformatischer Auswertung derzeit noch etwa eine Woche, sodass sich NGS vor allem in universitären und anderen großen Pathologien etabliert hat. Durch die Möglichkeit, zahlreiche Proben parallel zu analysieren und mit geeigneten Gen-Panels mehrere Mutationen gleichzeitig nachzuweisen, lohnt sich der höhere Aufwand allerdings in großen Laboren zunehmend auch im Routinebetrieb. 

Als Ergebnis erhält man bei allen Verfahren eine Ja-Nein-Aussage (Mutation nachweisbar/nicht nachweisbar), die wie oben beschrieben von der Qualität der Probe und der Nachweisgrenze der Methode abhängt. Unter Berücksichtigung einer relativ großen methodischen Streubreite lassen sich mit verschiedenen Verfahren zusätzlich auch quantitative Aussagen (z. B. Zu- oder Abnahme im Therapieverlauf) machen.

Postanalytik

An die Mutationsanalyse schließen sich die technische und medizinische Validierung sowie die Befundung an. Die Validierung soll sicherstellen, dass die eingesetzten Verfahren geeignet sind, die medizinische Fragestellung zu beantworten. Im vorliegenden Beispiel lautet die Frage: Enthält die cfDNA des Patienten eine p.T790M-Mutation? 

Man unterscheidet zwischen analytischer und diagnostischer Validierung: Erstere überprüft die analytische Qualität, letztere die Aussagekraft des Ergebnisses. Die analytische Qualitätskontrolle wird im Fall der Mutationsanalyse entsprechend den Anweisungen des Herstellers durch Kontrollmaterialien geprüft, nach Möglichkeit ergänzt durch externe Ringversuche [8]. Ansprechpartner für die Teilnahme an Liquid-Biopsy-Ringversuchen in Deutschland ist die Qualitäts­sicherungs-Initiative Pathologie GmbH (https://quip.eu/de_DE/).

Die diagnostische Validierung bewertet die Aussagekraft des Liquid-Biopsy-Ergebnisses im Vergleich zu einem Goldstandard. Dabei gilt der Mutationsnachweis im Tumor­gewebe als Vergleichskriterium. Folgende zwei Begriffe sind zu unterscheiden: Die diagnostische Sensitivität beschreibt die Fähigkeit eines Tests, die gesuchte Mutation korrekt zu erkennen (also möglichst wenig falsch-negative Ergebnisse zu liefern), und die diagnostische Spezifität die Sicherheit, bei Abwesenheit der Mutation auch wirklich keine Mutation anzuzeigen (möglichst wenig falsch positive Ergebnisse). 

Hier ergibt sich im Fall der Liquid Biopsy ein noch ungelöstes Problem: Wegen der molekularen Heterogenität im Primär­tumor und in seinen Metastasen kann es vorkommen, dass eine Resistenz-vermittelnde Mutation wie p.T790M zwar im Blut nachweisbar ist, nicht aber – trotz sorgfältiger Biopsietechnik – in der Gewebeprobe. 

Ein solcher Liquid-Biopsy-Befund müsste also formal als falsch positiv gewertet werden, ist aber in Wirklichkeit valide und kann wegweisend für die Therapie sein.

Eine differenzierte Betrachtung zeigt [10], dass die Liquid Biopsy für aktivierende EGFR-Mutationen (etwa L858R oder Del19) in den meisten Studien dia­gnostische Spezifitäten von nahezu 100% erreicht, weil diese homogen über alle Läsionen verteilt sind. Für die Resistenz-vermittelnde T790M-Mutation können dagegen – im Vergleich zu Gewebe als Referenz – scheinbar schlechtere Spezifitäten im Bereich von nur 60% ermittelt werden [10]. Diese sind aber in Wirklichkeit nicht der Liquid Biopsy anzulasten, sondern durch die limitierte Sensitivität der Bestimmung in der Gewebeprobe bedingt, weshalb man nicht von „falsch positiv“ sprechen sollte. 

Falsch negative Befunde in der Liquid Biopsy kommen entweder dadurch zustande, dass die analytische Sensitivität verschiedener Methoden für die geringen ctDNA Konzentrationen zum sicheren Nachweis nicht ausreicht oder dadurch, dass der Tumor aufgrund seiner geringen Größe oder speziellen Lokalisation keine messbare ctDNA freisetzt. Deshalb ist bei einem negativen Befund nach Möglichkeit eine Nachbestimmung aus dem Gewebe anzustreben („komplementäre Testung“).

Für die medizinische Bewertung obliegt es dem befundenden Pathologen, alle Ergebnisse aus Gewebe und Blut darzustellen und etwaige Unsicherheiten zu benennen. Im Befund werden auch Angaben aus Genomdatenbanken wie COSMIC und CLINVAR vermerkt und gegebenenfalls Hinweise auf aktuelle klinische Studien gegeben, in die der Patient aufgenommen werden könnte.