Butyrophiline: Verwandte der B7-Familie, γδ-T-Zellrezeptorliganden und vieles mehr

Was sind Butyrophiline?

Namensgeber der Butyrophilinfamilie ist das Butyrophilin 1A1 (BTN1A1 im Menschen, Btn1a1 in der Maus). Es ist vor allem in der Membran von milchbildenden Epithelzellen und von Milchfettkü-gelchen zu finden und kontrolliert den Fettgehalt der Milch [1]. Hingegen ist die Funktion des im thymischen Epithel exprimierten Btn1a1 unklar [2]. BTN1A1 wie auch die anderen später identifizierten Mitglieder der BTN-Familien-Moleküle weisen im extrazellulären Bereich Gemeinsamkeiten mit der B7-Familie auf (Abb. 1).

Ihre zytoplasmatischen Bereiche enthalten hingegen eine juxta-membrane coiled-coiled Domäne und eine B30.2-Domäne, wie sie auch bei vielen Mitgliedern der für die angeborene Immunantwort wichtigen „tripartite-motif“-Familie (TRIM) zu finden sind [3] (Abb. 1). Im Menschen gibt es außer dem BTN1A1 fünf BTN-Proteine, deren Gene in einem Cluster am telomeren Ende des HLA-Komplexes auf Chromosom 6 lokalisiert sind. Von diesen sind BTN2A1, BTN3A1 (CD277), BTN3A2 und BTN3A3 in die Aktivierung von γδ-T-Zellen involviert [4–8]. BTN1- und BTN2-Gene tauchen mit der Entstehung von Wirbeltieren auf, die BTN3-Gene hingegen erst mit den plazentaren Säugetieren [3, 6]. Funktionelle BTN3-Moleküle wurden bisher außer in Primaten nur in wenigen anderen Spezies wie dem Alpaka gefunden [9, 10]. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Genen für Butyrophilin-artige Moleküle (BTNL), die in Zahl, Aufbau und chromosomaler Lokalisation z. T. deutliche, speziesspezifische Unterschiede aufweisen.

Butyrophiline und die γδ-T-Zellentwicklung

Einige BTN-, BTNL- und die mit ihnen verwandten Skint (Selection and upkeep of intraepitelial T cells)-Moleküle kontrollieren Entwicklung und Funktion von γδ-T-Zellen [3]. γδ-T-Zellen sind „nicht-konventionelle“ T-Lymphozyten, die einen γδ-T-Zellantigen-Rezeptor tragen (γδTZR) und in fast allen kiefertragenden Wirbeltieren (Gnathostomata) nachzuweisen sind. Die γδ-T-Zellen unterscheiden sich von den MHC-restringierten αβ-T-Zellen grundsätzlich in thymischer Entwicklung und den selektierenden Liganden [11]. Anders als bei den MHC-restringierten αβ-T-Zellen, deren TZR mit den CDR (Komplementaritäts-determinierenden Regionen) 1, 2 und 3 beider Ketten MHC-Peptidkomplexe binden, gibt es keine gemeinsame Klasse von γδTZR-Liganden. Die wenigen eindeutig identifizierten γδTZR-bindenden Antigene umfassen sowohl lösliche Moleküle wie Phycoerythrin und bakterielle Proteine als auch Zelloberflächenproteine. Letztere sind häufig stressinduzierte MHC- und MHC-artige Moleküle [10, 12–14], die im Fall der besonders gut charakterisierten murinen MHC-Klasse-I-artigen T10- und T22-Proteine fast ausschließlich mit den CDR3 der TZR-δ-Kette interagieren [13–15]. Die Stärke der γδTZR-Ligandeninteraktion steuert dabei die thymische Reifung bestimmter muriner γδ-T-Zellen, aber weniger im Sinne einer klassischen positiven und negativen Selektion als durch die Programmierung bestimmter Effektoreigenschaften wie der bei den murinen IFNγ- oder IL-17-produzierenden γδ-T-Zellpopulationen [11]. Die Expression bestimmter γδTZR korreliert außerdem mit einer Organpräferenz. So exprimieren die meisten zirkulierenden humanen Zellen TZR mit einer Vδ2-haltigen δ-Kette, während bei den residenten humanen γδ-T-Zellen die Vδ1- Ketten dominieren. Bei den γδ-T-Zellen der Maus gibt es hingegen eine klare Korrelation von Organpräferenz und Vγ-kodierten Bereichen des TZR. Diese geht mit charakteristischen γδTZR-Gen­um­lage­run­gen zu unterschiedlichen Zeiten der Embryonalentwicklung im Thymus einher und der Migration der verschiedenen γδ-T-Zellen in unterschiedliche Körperregionen, vor allem in (mukosalen) Epithelien [11]. Das prominenteste Beispiel hierfür sind die Dendritischen Epidermalen T-Zellen (DETC). Diese haben eine dendritische Morphologie, befinden sich in der Epidermis und tragen einen uniformen TZR. Sie produzieren u. a. Wachstumsfaktoren für die Hautzellen und erhalten so die Gewebsintegrität. Die Entdeckung einer Mausstammvariante mit DETC-Verlust ermöglichte es erstmals, einen Zusammenhang zwischen γδ-T-Zellentwicklung und einem Btn-verwandten Gen, dem Skint1-Gen, nachzuweisen (Abb. 1) [16]. Im Menschen und vielen anderen Primaten ist das verwandte SKINTL-Gen nicht funktionell und es sind auch keine DETC zu finden. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist allerdings der Javaaffe (Macaca fascicularis), der sowohl ein funktionelles SKINTL-Gen als auch DETC besitzt, die jedoch anders als bei der Maus eine gewisse TZR-Diversität aufweisen. Ob die Entwicklung der Makaken-DETC durch das SKINTL-Gen kontrolliert wird, ist unklar und auch, ob das Maus-Skint1 an den TZR der DETC bindet [17]. 
BTNs und BTNLs sind strukturell sehr ähnlich und umfassen in Maus und Mensch Genfamilien von bis zu zehn Mitgliedern [3] (Abb. 1). BTNL-Heterodimere können γδ-T-Zellen aktivieren und halten die Homöostase von epithelialen γδ-T-Zellen des Dünndarms aufrecht. Dabei interagieren Maus-Btnl1-Btnl6-Heterodimere mit Vγ7-positiven Maus-TZR und humane BTNL3-BTNL8-Heterodimere mit menschlichem Vγ4-positiven TZR [18, 19]. Für das humane BTNL3 ist zudem eine direkte Bindung an die Vγ-Gen-kodierte hypervariable Region 4 (HV4) des TZR nachgewiesen [20], die der Bindung mancher Superantigene an Vβ-kodierte Bereiche des αβTZR ähnelt. Eine Hypothese zur Funktion dieser besonderen Art der Interaktion, die sich grundsätzlich von bisher bekannten TZR-Ligandeninteraktionen unterscheidet, ist, dass die BTN(L)-Vγ-Interaktion die lokale Homöostase der γδ-T-Zellen aufrechterhält, während Antigene an die TZR-Komplementaritäts-determinierende Region 3 (CDR3) binden und damit Antigen-spezifische adaptive Immunantworten ermöglichen [20, 21]. Dass diese unterschiedlichen Topologien der TZR-Ligandenkomplexe unterschiedliche TZR-vermittelte Signale und Zellfunktionen induzieren [22], liegt nahe, ist aber noch nicht nachgewiesen.

Phosphoantigen-reaktive Vγ9Vδ2-T-Zellen und Butyrophiline

Zwei klassische Butyrophiline, nämlich BTN3A1 und BTN2A1, sind für die Aktivierung der Vγ9Vδ2-T-Zellen durch Phosphoantigene (PAg) essentiell [4–8]. Vγ9Vδ2-T-Zellen sind nach ihren TZR benannt, die eine typische Umlagerung der γ-Kette (Vγ9-JP) sowie ein Vδ2-kodiertes Segment enthalten. 1–5 % der gesamten Lymphozyten und damit die meisten γδ-T-Zellen des menschlichen Blutes sind Vγ9Vδ2-T-Zellen [23]. Vγ9Vδ2-T-Zellen sind multifunktional und insbesondere im Zusammenhang mit γδTZR-basierten Therapien interessant (siehe Artikel von Dieter Kabelitz in diesem Heft). Die Vγ9Vδ2-T-Zell-aktivierenden PAg sind pyrophosphorylierte Metabolite des Isoprenoidstoffwechsels, z. B. das in allen Zellen vorkommende Isopentenyl-Pyrophosphat (IPP) oder das in der Stimulation 10.000-mal potentere (E-)4-Hydroxy-3-Methyl-But-2-Enyl Pyrophosphat (HMBPP). HMBPP ist der Vorläufer des IPPs im DOXP-Stoffwechselweg, den viele Eu-bakterien (z. B. Mykobakterien) und apikomplexe Parasiten (Plasmodium spp., Toxoplasma gondii), aber auch Chloroplasten nutzen [24]. Es initiiert die massive Vγ9Vδ2-T-Zellvermehrung bei Infektionen mit HMBPP-Produzenten, bei denen der Anteil von Vγ9Vδ2-T-Zellen auf bis zu 50 % der Blut-T-Zellen ansteigt [23, 24]. In manchen Tumorzellen ist der IPP-Spiegel erhöht, was wiederum zur Erkennung und Eliminierung dieser Zellen durch Vγ9Vδ2-T-Zellen führen kann [25]. Ein erhöhter intrazellulärer IPP-Spiegel und die daraus folgende Vγ9Vδ2-T-Zellaktivierung ist aber auch nach der Gabe von Aminobisphosphonaten wie z. B. Zoledronat, also Medikamenten, die bereits bei der Therapie von Knochenmetasen oder Osteoporose eingesetzt werden [26–28], zu beobachten.
Ein Durchbruch zum Verständnis der PAg-induzierten Vγ9Vδ2-T-Zell­aktivierung war der Befund, dass auf αβ-T-Zellen und NK-Zellen immunmodulatorisch wirkende BTN3-spezifische Antikörper [29] in Kulturen mit humanen mononukleären Blutzellen spezifisch Vγ9Vδ2-T-Zellen aktivierten (agonistische mAk) oder eine PAg-induzierte Vγ9Vδ2-T-Zellstimulation inhibierten (antagonistische mAk) [4]. Dieser Effekt war dabei aber nicht auf die Bindung der mAk an das auch von den Vγ9Vδ2-T-Zellen selbst exprimierte BTN3A1 zurückzuführen, sondern auf die Bindung an die BTN3A1-positiven Zielzellen bzw. Antigen-präsentierenden Zellen [4]. 
Die PAg binden nicht direkt an den Vγ9Vδ2-TZR, sondern müssen „präsentiert“ werden [23]. Diese „Präsentation“ wird durch die Interaktion des PAg mit der intrazellulären B30.2-Domäne des BTN3A1 eingeleitet, die dem BTN3A2-Molekül fehlt und beim BTN3A3 inaktiv ist [5] (Abb. 1). Die PAg-induzierte Konformationsänderung des intrazellulären Bereichs des BTN3A1 resultiert schließlich in einer Veränderung der Zelloberfläche, die dann auf bisher noch unbekannte Weise von den Vγ9Vδ2-T-Zellen „erkannt“ wird. Ob die Erkennung eine Bindung des BTN3A1-Moleküls an den Vγ9Vδ2-TZR beinhaltet, ist umstritten [6]. Unstrittig ist, dass für eine effektive PAg-Präsentation das BTN3A1 mit dem BTN3A2 und/oder dem BTN3A3 kooperieren muss [9, 10, 18]. Zum mechanistischen Verständnis ist dabei ein Blick über die Speziesgrenze hinaus hilfreich. Das Alpaka ist neben Menschen und Affen eines der wenigen Säugetiere, das funktio­nelle TRGV9-, TRDV2- und BTN3-Gene und PAg-reaktive Vγ9Vδ2-T-Zellen besitzt [9, 10]. Tauscht man nun den intrazellulären Bereich des humanen BTN3A1 gegen den des Alpaka-BTN3 aus, kann dieses Molekül PAg mindestens so gut präsentieren wie der Komplex der verschiedenen humanen BTN3-Moleküle. Die intrazelluläre Alpaka-BTN3-Domäne macht also die Kooperation der humanen BTN3A-Molekülklassen überflüssig. Eine vergleichende Sequenzanalyse zusammen mit phylogenetischen Betrachtungen lässt uns deshalb ein primordiales BTN3 postulieren, das in seiner Grundstruktur dem des Alpakas ähnelt [9, 10]. 
Ein anderes Beispiel dafür, wie Speziesvergleiche dazu beitragen, die Vγ9Vδ2-T-Zellaktivierung durch PAg besser zu verstehen, ist der Vergleich von BTN3A1-transduzierten Nagerzellen mit Nagerzellen, die einzelne, humane Chromosomen besitzen. Ein solcher Vergleich zeigte, dass neben BTN3A1 weitere auf dem humanen Chromosom 6 lokalisierte Gene für die PAg-Präsentation benötigt werden [30]. Um diese zu identifizieren, nutzten wir die Methode der „Radiation Hybrids“. Hierfür wurden Nagerzellen, die das humane Chromosom 6 enthielten, auf dem das gesuchte Gen liegen sollte, bestrahlt und mit Nagerzellen fusioniert [7]. Dabei werden in den Fusionszellen bestrahlungsinduzierte Bruchstücke des humanen Chromosoms zufällig in die Nager-Chromosomen integriert, und Fusionszellen, die das PAg präsentieren, sollten also humane Genom-Fragmente mit dem gesuchten Gen enthalten. Der Vergleich der humanen Genomanteile der stimulierenden Fusionszellen ergab schließlich einen gemeinsamen Bereich von rund 150 kB, der u. a. das BTN2A1-Gen enthielt [7]. Die Bedeutung des BTN2A1-Gens für die PAg-Präsentation wurde zweifach nachgewiesen: 

• BTN2A1-Inaktivierung mittels CrispR-Cas9-Mutagenese verhinderte die PAg-Präsentation durch eine humane Zelllinie; 
• Nagerzellen, die mit humanem BTN3A1 und BTN2A1 transduziert wurden, präsentierten PAg. Damit war klar, dass sowohl BTN3A1 als auch BTN2A1 für die PAg-Präsentation essentiell sind [7]. 

Unsere Kooperationspartner um Ben Willcox (Birmingham, UK) demonstrierten schließlich eine direkte Bindung der Vγ9-Kette des TZR an BTN2A1, deren Topologie den Interaktionsbereichen der BTN3L- und der Vγ4-Kette verblüffend ähnelte. Darüber hinaus war die Bindung des BTN2A1 an das Vγ9 von der δ-Kette des TZR unabhängig [7, 20]. Unabhängig von uns und mithilfe eines anderen Screeningsystems identifizierten die Ar-beitsgruppen von Godfrey und Uldrich in Melbourne ebenfalls BTN2A1 als Schlüsselmolekül der PAg-Präsentation und kamen auch bezüglich der Interaktion zwischen BTN3A1, BTN2A1 und dem Vγ9Vδ2-TZR zu erfreulich ähnlichen Ergebnissen [8]. Wir postulieren nun, dass bei der PAg-vermittelten Stimulation neben BTN2A1- und BTN3-Molekülen weitere Komponenten beteiligt sind. Allerdings bleibt unklar, was der Vγ9Vδ2- TZR auf den PAg-präsentierenden Zellen eigentlich erkennt. Unsere derzeitige Arbeitshypothese lautet, dass die Interaktion der TZR mit den verschiedenen CDR3-bindenden Liganden andere zelluläre Programme abruft als die ausschließlich Vγ-vermittelte BTN(L)-Bindung. Sie ist in Abb. 2 und der dazugehörigen Legende dargestellt [6, 7]. 

Zusammengefasst kann also festgestellt werden, dass BTN- und BTN-artige Moleküle für die geregelte Entwicklung und TZR-vermittelte Aktivierung vieler, wenn nicht aller γδ-T-Zellen essentiell sind [19, 20].

Butyrophiline und Immuntherapie

Abschließend sei auf die immunmodulatorischen Eigenschaften der BTN(L) hingewiesen. Viele BTN(L)-spezifische monoklonale Antikörper verstärken T-Zellantworten, während BTN(L) Überex-pression, lösliche BTN(L) Moleküle und BTN(L)-Fc-Konstrukte T-Zellantworten inhibieren (z. B. [2, 29]). Den überzeugendsten Hinweis auf die physiologische Bedeutung von BTN-Molekülen als Immunmodulatoren geben Btn2a2-defiziente Mäuse, die eine verstärkte αβ-T-Zellantwort aufweisen. Diese ist, wie in Zelltransferexperimenten gezeigt wurde, auf die fehlende Btn2a2-Expression der Antigen-präsentierenden Zellen zurückzuführen [31]. Darüber hinaus wurde letztes Jahr BTN3A1 als Suppressor tumor­spezifischer αβ-T-Zellantworten im Detail beschrieben [32]. Die Suppression wird dabei auf eine Bindung des BTN3A1 an das N-glykosylierte CD45 zurückgeführt, die die Segregation aus immunologischen Synapsen verhindert und somit die TZR-Signaltransduktion beeinträchtigt. Die Immunsuppression konnte sowohl in der Zellkultur als auch in BTN3A1-transgenen Mäusen durch verschiedene BTN3-spezifische monoklonale Antikörper aufgehoben werden [32]. Dies ist besonders deshalb interessant, da derzeit die humanisierte Version eines agonistischen BTN3A-spezifischen mAk (ICT01) in einer Phase-I/II-Studie bei verschiedenen Tumoren getestet wird (ClinicalTrials.gov-Identifier: NCT04243499). Sollte hier der erhoffte therapeutischen Effekt eintreten, gälte es zu klären, inwieweit dies auf die Antikörper-induzierte Vγ9Vδ2-T-Zellaktivierung und/oder die Neutralisierung von BTN3A1 als Immunsuppressor der adaptiven αβ-T-Zellantwort zurückzuführen ist. BTN(L)-Moleküle sind also nicht nur für Entwicklung und Funktion von γδ-T-Zellen essentiell, sondern eröffnen auch immuntherapeutische Optionen, wie sie bereits für andere Mitglieder der B7-Familie im Rahmen der Adressierung von Immuncheckpoints erfolgreich genutzt werden [33].