Diagnostik von respiratorischen Infektionen: Syndromisches Testen – Schlagwort der Saison?

Natürlich nicht – das Wort des Jahres lautet ja „Corona-Pandemie“. Aber die Labormediziner und Kliniker, die jetzt, im Winterhalbjahr 2020, den Erreger einer Atemwegserkrankung sicher diagnostizieren sollen, haben bei der Diagnostik von Atemwegsinfektionen an mehr als an COVID-19 zu denken, sei es als Coinfektion oder als alleinige Ursache einer Erkrankung. Besonders wenn man bedenkt, dass sowohl COVID-19 als auch die Influenza eine strenge Quarantäne erforderlich machen. Deshalb heißt es, einzuordnen, welcher oder welche Erreger für die Symptome eines Patienten verantwortlich sein können. Genau dafür eignet sich das sogenannte syndromische Testen hervorragend. Denn die Multiplex-PCR erlaubt den Nachweis vieler relevanter respiratorischer Erreger parallel in einem oder wenigen Testansätzen. Welche Erreger in das syndromische Testen einbezogen werden, kann der Diagnostiker auswählen, durch die Wahl des Testanbieters, der Assay-Kits und letztendlich auch durch die Wahl der Primer in einem Reaktionsansatz (Tubes).
Zwölf Firmen stellen ihre sehr zuverlässigen Assays zum Nachweis respiratorischer Erreger vor. Einige Anbieter haben zwar ein wesentlich größeres Test-Portfolio, begrenzen sich hier aber auf ausgewählte Assays. In unserer Internet-Tabelle [1] können Sie das komplette Angebot der teilnehmenden Firmen zum Thema „Respiratorische Erreger“ einsehen.
Der Nachweis, der zuerst Erfolg verspricht, der Goldstandard zum schnellen Nachweis respiratorischer Infektionen, ist der des Erbgutes von Infektionserregern mittels Nukleinsäureamplifikationsverfahren (NAT).

Tabellarische Übersicht Respiratorische Erreger

Denn sobald ein Erreger seinen Wirt gefunden hat, fängt er an, sich zu vermehren. Seine DNA oder RNA lässt sich schon früh, nach 2 bis 4 Tagen, in den oberen Atemwegen nachweisen, während die Immunreaktion und die Ausbildung von Antikörpern (IgM und IgA) gegen die Erreger erst mit einer Verzögerung von ca. 14 Tagen stattfindet. Die Bildung von IgG-beginnt erst nach 4 bis 8 Wochen.
Spätestens seit Ausbruch der Corona-Pandemie ist der Erreger-Direktnachweis durch NAT, hauptsächlich durch PCR, auch unter Laien ein beliebtes Gesprächsthema und die Labore sind mittlerweile am Limit ihrer Kapazitäten. In geringem Maße stehen auch isothermale Verfahren der Nukleinsäureamplifikation zur Verfügung. Weitere Informationen finden Sie in unserer Übersichtstabelle im Internet [1].
Mit einer Verzögerung von ca. 24 Stunden im Vergleich zur wesentlich sensitiveren PCR lassen sich die respiratorischen Erreger auch immunologisch als Antigen aus dem Nasen-Rachen-Raum nachweisen. Als La­bortests kommen hauptsächlich ELISA und CLIA-Assays zum Einsatz; am Point of Care sind es meist Lateral-Flow-Immunoassays.
Der Antigen-Nachweis ist um einen Faktor 103 weniger sensitiv als der PCR-Test und wird hauptsächlich zur Identifizierung von symptomfreien, infizierten Personen im Umfeld eines Ausbruchs oder für regelmäßige bzw. engmaschige Testungen an Personal von Krankenhäusern oder Pflegeheimen herangezogen. Bei den POC-Tests kommt noch ein weiterer Sensitivitätsverlust um einen Faktor 102 dazu. Mit anderen Worten: Ein PCR-Test ist um einen Faktor 105 sensitiver als ein Antigen-Schnelltest. Trotz dieser Einschränkungen sind die Antigen-Assays eine willkommene Ergänzung zu den NAT-Verfahren, deren Ressourcen stark beansprucht sind. Sowohl die Amplifikationsverfahren als auch der immunologische Nachweis von Erregern erfolgen hauptsächlich durch den Nasen-Rachen-Abstrich. Die Auswahl des Probenmaterials richtet sich z.  T. auch nach dem zu erwartenden Erreger. Unser Denken wird zurzeit natürlich sehr stark von der Pandemie durch das SARS-Coronavirus und – mittlerweile – auch durch die Influenza-Viren beherrscht.
Die Antikörper-Nachweise geben entweder zu einer akuten (IgM, IgA) oder zu einer abgelaufenen Infektion (IgG) Auskunft. Der Nachweis von IgG-Antikörpern kann beispielsweise für Pflegekräfte sehr bedeutsam sein.

Nukleinsäure-Nachweis im Labor

Ein Großteil der hier vorgestellten Assays weist die DNA oder RNA eines Erregers mittels klassischer PCR nach. Mit Ausnahme des POC-Tests verwenden alle Assays ein Realtime-Verfahren, bei dem der sogenannte Ct-Wert den PCR-Zyklus benennt, der erstmals das Hintergrundrauschen der Fluoreszenz eindeutig übersteigt. Der Wert ist umgekehrt proportional zur Anzahl Kopien einer Zielsequenz (Target). Handelt es sich bei dem Target beispielsweise um RNA des SARS-CoV-2-Virus oder eines anderen Infektionserregers, kann zwischen infizierten und infektiösen Personen unterschieden werden. Ab einem Ct-Wert >30 geht man davon aus, dass ein Patient nach durchgemachter Infektion nicht mehr ansteckend ist. Da diese Werte allerdings von Hersteller zu Hersteller variieren, handelt es sich nur um eine ungefähre Angabe.
In einer Multiplex-Reaktion ist es außerdem schwierig, für jedes Target innerhalb eines Reaktionsgefäßes den Ct-Wert anzugeben. Abhilfe schafft eine Technologie, die Ct-Werte  in verschiedenen Farbkanälen (Wellenlängen) erfasst und dadurch für jede Zielsequenz einen Ct-Wert angeben kann. Eine interessante Variante der PCR ist die 3-Basen-Technologie. Die Nukleinbasen der Probe werden während der Extraktion einer chemischen Reaktion unterzogen, um alle Cytosin-Basen in Uracil umzuwandeln. Während der späteren Amplifikation werden die Cytosin-Basen als Thymin detektiert. Die Aufreinigung der Nukleinsäuren erfolgt danach klassisch mittels Magnetic Beads. Auch die anschließende PCR läuft wieder nach bekanntem Schema, mit dem Unterschied, dass die Primer natürlich für die 3-Basen-Technologie entwickelt sind. Die Konvertierung erhöht die Homogenität der Basensequenz. Auf 3-Basen-Sequenzen basierende Primer und Sonden weisen laut Hersteller weniger Fehlpaarungen auf und sind in Assays zum Nachweis, z. B. von Virussubtypen, weniger kreuzreaktiv. Die Effizienz der PCR wird verbessert.

Nukleinsäure-Nachweis am POC

Sowohl NAT-Verfahren als auch Antigen- und Antikörper-Nachweise sind als Point-of-Care-Tests erhältlich. Ein POC-Test auf PCR-Basis, bei dem Probenvorbereitung, Nukleinsäure-Extraktion und -Aufreinigung, die eigentliche PCR-Reaktion, natürlich inklusive Auswertung, ablaufen, besteht nicht nur aus dem Assay in Form einer Testkassette oder eines Teststreifens, wie das bei den Lateral-Flow-Assays zum Antigen- oder Antikörper-Nachweis üblich ist. Ein Thermocycler muss für die Temperaturzyklen sorgen; verschiedene, voneinander getrennte Kompartimente müssen zur richtigen Zeit dem Reaktionsansatz zugeführt werden. Die entstehenden Reaktionsprodukte oder die Endprodukte nach der PCR müssen bestimmt werden. Im Fall des Assays auf S. 253 läuft die gesamte PCR – genau genommen zwei PCR-Reaktionen – innerhalb von 45 Minuten ab. Die Personalbindung beträgt dabei nur zwei Minuten.

Antigen-Nachweis am POC

Die immunologischen Schnelltests dienen entweder dem Nachweis des Antigens in der frühen Phase der Infektion oder dem Nachweis von Antikörpern, frühestens 14 Tage nach Infektion. Ein Hersteller bietet verschiedene Assay-Kombinationen für den POC-Bereich an. Diese Kombinations-Tests können als Antigen- und Antikörper-Nachweis von COVID-19 oder zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A + B oder SARS-CoV-2, Influenza A + B und RSV auf Basis eines Lateral-Flow-Fluoreszenz-Immunoassays durchgeführt werden. Die Nachweisreaktion basiert auf dem ELISA-Prinzip. Der Analyt, im vorliegenden Fall die nachzuweisenden Antigene, werden auf ein poröses Papier oder Polymer aufgetragen. Die Probe wandert mit der Flüssigkeit durch verschiedene Zonen. Als erstes trifft sie auf eine Zone, in der spezifische, mit einem Chromophor konjugierte Antikörper das nachzuweisende Antigen binden. Der so entstandene Antigen-Antikörper-Komplex wandert mit der Flüssigkeit weiter zu einem Bereich, in dem ein weiterer, spezifischer Antikörper immobilisiert ist und den Antigen-Antikörper-Chromophor-Komplex – wenn vorhanden – festhält und konzentriert, sodass die Reaktion in der Regel mit dem bloßen Auge abgelesen werden kann. Eine Kosten-Nutzen-Analyse für einen Influenza-Schnelltest in der Notaufnahme eines Krankenhauses lesen Sie hier auf S. 246–249.

Antikörpernachweis

Die Antikörpernachweise geben Auskunft über eine akute Infektion in der Spätphase oder eine bereits abgelaufene Auseinandersetzung mit einem infektiösen Agens, in dem Fall mit einem respiratorischen Erreger. In der Regel weisen IgM- und IgA-Antikörper auf eine akute Infektion hin (innerhalb von 2–4 Wochen nach Erregerkontakt) und neutralisierende IgG-Antikörper auf eine abgelaufene. Die Antikörper-Assays können gegen unterschiedliche Strukturen des nachzuweisenden Erregers gerichtet sein. Dementsprechend unterscheiden sich auch ihre Ergebnisse. In dieser Übersicht stellen drei Firmen ihre Antikörper-Assays vor: für den Einsatz im Labor im Rahmen des Gesamt-Portfolios zum SARS-CoV-2-Nachweis (S. 262), als Schnelltests zum kombinierten Nachweis respiratorischer Erreger oder als Schnelltest auf SARS-CoV-2.

Sonderfall Durchflusszytometrie

Einen ganz anderen Ansatz verfolgt die Durchflusszytometrie, die eingesetzt werden kann, um einerseits COVID-19 besser zu verstehen (Forschung) und andererseits, um den Immunstatus von COVID-19-Patienten, z. B. durch eine Quantifizierung von T- und B-Lymphozyten sowie NK-Zellen, besser einschätzen zu können.

Ausblick oder Wunschtraum?

Vielleicht werden wir in Zukunft aber auch ganz andere Wege gehen, um respiratorische Erkrankungen zu diagnostizieren: Forscher des MIT haben eine App auf Basis Künstlicher Intelligenz (KI) entwickelt, die das künstliche Husten eines Menschen, ähnlich wie bei einer Auskultation, analysiert. Sie konnten nach der Auswertung von mehr als 70.000 „Hustern“ mit einer Sensitivität von 98,5 % und einer Spezifität von 94,2 % COVID-19-Infektionen nachweisen [2]. 

 

Dr. Gabriele Egert
Mitglied der Redaktion