Somit stammt cfDNA vor allem aus Geweben mit einem hohen Zellumsatz („turnover“). Die Menge der aus Tumorzellen freigesetzten cfDNA ist abhängig von der Tumorentität, der Tumorlokalisation, der Vaskularisierung, der Größe des Tumors und von einer eventuell vorliegenden Metastasierung [9, 18]. 

Aufgrund der kontinuierlichen Freisetzung aus apoptotischem und nekrotischem Tumorgewebe stellen diese zellfreien Nukleinsäuren (ctDNA) einen sensitiven Parameter zur Bestimmung der Tumorlast dar, der minimal-invasiv gewonnen werden kann [17]. Durch die kurze Halbwertszeit der Fragmente von ca. 30 Minuten [19] ist eine Korrelation zwischen der aktuellen ctDNA-Menge im Blut und der Anzahl von Tumorzellen im Körper anzunehmen. Dies lässt die Vermutung zu, dass Änderungen der ctDNA-Menge in Blut und Speichel die Veränderungen der Tumorlast nahezu in Echtzeit wiedergeben können.

Die aus malignen Tumoren oder deren Metastasen stammende ctDNA trägt tumorspezifische somatische Mutationen in Form von vorbekannten entitätsspezifischen sowie individuellen Mutationen, Fusionstranskripten oder genetischen Rearrangements [3] und kann dadurch von cfDNA aus gesunden Körperzellen unterschieden werden [20]. 

Allerdings ist zur Detektion der verhältnismäßig geringen Anzahl der Zellfragmente, insbesondere bei geringer Tumorlast, eine höchst sensitive Detektionsmethode erforderlich. Eine hierfür geeignete Methode ist die digitale PCR.

Ein bislang großes Handicap der Liquid Biopsy war die Notwendigkeit eines sensitiven Nachweisverfahrens aufgrund der meist äußerst geringen ctDNA-Menge (z. T. < 0,1 ng/ml). Zur Lösung dieses Kernproblems beim Einsatz von ctDNA zur Untersuchung tumorgenetischer Mutationen ist die standardmäßig verwendete Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nur wenig geeignet. Diese erlaubt keine absolute Quantifizierung von ctDNA-Molekülen und kann durch PCR-Duplikate Messergebnisse verzerren [11]. 

Weiterentwickelte digitale PCR-Systeme (dPCR) ermöglichen es als quantitative Endpunkt-Verfahren ohne Verwendung externer Standardkurven, die Anzahl der cfDNA-Moleküle präzise zu bestimmen. Dies spart neben Zeit und Reagenzien vor allem wertvolles Probenmaterial ein. Hierbei wird der Reaktionsansatz auf sehr viele kleine Reaktionsgefäße verteilt. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR für jedes Kompartiment durchgeführt und man erhält für jedes Kompartiment ein positives oder negatives Signal. Mit dieser Methode können allerdings nur wenige Gene gleichzeitig untersucht werden, dafür aber mit hoher analytischer Sensitivität und Spezifität. Daher sind diese Verfahren vornehmlich dazu geeignet, bekannte tumorgenetische Alterationen nachzuweisen. Ein Beispiel hierfür wäre die T790M-Mutation im EGFR-Gen, die bereits in der klinischen Praxis mittels Liquid Biopsy bei NSCLC-Patienten analysiert wird.

Durch den Einsatz der Droplet Digital PCR (ddPCR) ist es zudem möglich, den Methylierungsstatus bestimmter Gene in Blut- und Speichelproben zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass bei HNSCC Tumorsuppressor-Gene oftmals bereits in frühen Stadien hypermethyliert vorliegen, somit „ausgeschaltet“ sind, wodurch das unkontrollierte Zellwachstum gefördert wird. Zudem gilt mittlerweile als gesichert, dass es eine Korrelation zwischen Rauchen, einem Risikofaktor für die Entstehung von HNSCC, und der Hypermethylierung in Promotorbereichen von Tumorsuppressor-Genen gibt [21]. Diese Tatsache erscheint therapeutisch äußerst interessant: Eine Phase-II-Studie untersucht aktuell bei HNSCC-Patienten den Einsatz von demethylierenden Therapeutika (5-Azacitidin, welches DNA-Methyltransferasen hemmt), um „ausgeschaltete“, aber funktionsfähige Gene wieder zu aktivieren [22].

30% der Kopf-Hals-Tumoren werden in einem fortgeschrittenen Tumorstadium diagnostiziert, was einen negativen Einfluss auf die Prognose und das Gesamtüberleben hat [23]. Denn trotz Fort-schritten in der Tumorchirurgie und zahlreicher neuer Therapieansätze, wie der Immuntherapie und der gezielten EGFR-Antikörpertherapie, ist das Gesamtüberleben bei metastasierten oder rezidivierten Tumorstadien seit Jahrzehnten nahezu unverändert schlecht, und beträgt im Median beispielsweise für HNSCC nur sechs bis neun Monate. 

Durch den Einsatz des Liquid-Biopsy-Verfahrens bei Risikopatienten oder bei Auftreten klinisch verdächtiger Läsionen (Leukoplakien) könnten diese Krebsvorstufen minimal-invasiv untersucht werden. Saintigny et al. gingen kürzlich der Frage nach, ob bestimmte Genaktivitäten die Malignom-Entwicklung aus Vorstufen beim HNSCC begünstigen [24]. Sie konnten zeigen, dass eine erhöhte Expression eines Wachstumsfaktor-Rezeptors (c-Met-Rezeptor) den Übergang einer Leukoplakie in ein Malignom vorantreibt [24]. Eine Überaktivierung des Met-Signalwegs wurde bei verschiedenen Tumorarten, auch dem 

HNSCC, als Treibermutation identifiziert. Therapien, die selektiv entweder auf den 

c-Met-Rezeptor oder auf seinen Liganden (Hepatocyte Growth Factor, HGF) abzielen, haben bereits in Studien antineoplastische Wirkungen gezeigt und stellen damit eventuell eine neue Therapieoption beim 

HNSCC und bei dessen Prävention dar [25].

Zahlreiche Studien haben sich in den letzten Jahren zum Ziel gesetzt, die molekulare Biologie der HNSCC zu erforschen und potenzielle Angriffspunkte für die Liquid Biopsy bei Kopf-Hals-Tumoren zu ermitteln. Im Projekt The Cancer Genome Atlas (TCGA) wurden mittels Next Generation Sequencing (NGS) 279 Kopf-Hals-Tumorpatienten untersucht, um die Vielfalt somatischer Veränderungen u. a. beim HNSCC zu identifizieren [26]. Hierbei konnten Unterschiede sowie Gemeinsamkeiten zwischen HPV-positiven und HPV-negativen Tumoren gezeigt werden, die in zukünftigen Therapieansätzen eine Rolle spielen könnten [26].

Die anatomischen und pathologischen Eigenschaften der HNSCC ermöglichen einzigartige Anwendungen der ctDNA. Es handelt sich hier per definitionem um Schleimhauterkrankungen; daher haben alle Tumoren Bezug zur Schleimhautoberfläche. Demnach kann ctDNA auf zwei Wegen in Körperflüssigkeiten gelangen und dort detektiert werden ([12]; Abb. 1).

Zum einen gelangt ctDNA über die basale Tumoroberfläche ins Blut, zum anderen wird sie apikal in den Speichel freigesetzt. Dieses Modell konnten Weber et al. auch für MicroRNA bestätigen [27]. Sie konnten zeigen, dass sowohl Blut- als auch Speichelproben zur Liquid Biopsy bei HNSCC verwendet werden können und detektierten ctDNA und exosomale MicroRNA im Speichel. Durch den engen Kontakt zur Mundhöhle enthält der Speichel von Patienten mit Oropharynx-Karzinom erwartungsgemäß viel ctDNA und das bereits in frühen Tumorstadien [28]. Speichel ist einfach und nicht-invasiv zu gewinnen sowie kostengünstig und daher ein geeignetes Analysemedium zur Entwicklung von Biomarkern, die der Erkennung und dem Monitoring von Erkrankungen wie des Oropharynx-Karzinoms dienen [29]. Wang et al. konnten im Rahmen ihrer Studie bei 100% der untersuchten HNSCC-Patienten, die an einem Tumor der Mundhöhle erkrankt waren (n = 46), ctDNA nachweisen. Bei 75% befand sich die Erkrankung im Frühstadium. Dies rückt die Flüssigbiopsie mit der ctDNA-Analytik aus Speichelproben in den Fokus der Krebsfrüherkennung von HNSCC der Mundhöhle. 

Bettegowda et al. quantifizierten in einer Studie ctDNA im Plasma von 410 Patienten mit 18 verschiedenen soliden Tumorentitäten und konnten, neben einer stadien- und patientenindividuellen Nachweisvariabilität, in 70% der untersuchten metas­tasierten Kopf-Hals-Tumoren ctDNA detektieren [18]. Auch wenn die ctDNA-Menge eine hohe Varianz zwischen Tumorpatienten aufweist, konnte patientenindividuell eine zuverlässige positive Korrelation mit der Tumorlast nachgewiesen werden. Demnach kann die Höhe des ctDNA-Anteils als Messgröße für die Tumorlast verstanden werden [18, 30–32].

Außerdem konnte gezeigt werden, dass Tumoren, die bereits in niedrigen Stadien (I, II) ctDNA ins Blut abgeben, häufig eine schlechtere Prognose zeigen [35]. Diese Feststellung ist Ausgangspunkt zukünftiger prospektiver Studien, um die prognostische und klinische Relevanz des ctDNA-Nachweises sowohl in frühen als auch in späten Stadien von HNSCC-Erkrankungen zu evaluieren. 

Ähnliches konnte in einer prospektiven klinischen Follow-up-Studie auch für die Detektion zirkulierender Tumorzellen (CTCs) bei HNSCC-Patienten gezeigt werden. Patienten ohne Nachweis von CTCs im Blut zeigten ein signifikant längeres krankheitsfreies Überleben [33].

Somit könnten Flüssigbiopsien in Zukunft gegebenenfalls zur prognoserelevanten Unterscheidung von ctDNA-/CTC-positiven und -negativen Tumorstadien dienen. Dies könnte konsequenterweise einen Einfluss auf die Indikation zur adjuvanten Therapie haben. Insbesondere bei Kopf-Hals-Tumoren wird aktuell in prospektiven Studien versucht, die therapieinduzierte Morbidität durch eine reduzierte Therapieintensität zu verringern, ohne dabei die Chance auf Heilung zu gefährden. Hier könnte die Liquid Biopsy aus Blut- oder Speichelproben in Zukunft wertvolle Hinweise für die Risikostratifizierung liefern. 

Um zielgerichtete Therapeutika in der Tumortherapie einsetzen zu können, muss oftmals der Mutationszustand eines Biomarkers bestimmt oder die Expressionsrate analysiert werden. Ein Beispiel hierfür ist der EGFR-Status vor dem Einsatz einer Anti-EGFR-Therapie mit Cetuximab (Erbitux®): Eine Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors wurde in über 90% der Kopf-Hals-Tumoren gefunden [34] und ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert ([35]; Abb. 3). Doch es besteht die Option einer zusätzlichen zielgerichteten Therapie mit Cetuximab, welche seit 2006 zur Behandlung lokal fortgeschrittener HNSCCs in Kombination mit einer Radiotherapie und seit 2008 zur Erstlinientherapie des rezidivierten/metastasierten HNSCC in Kombination mit platinhaltiger Chemotherapie (Cis- oder Carboplatin plus 5-Fluorouracil) zugelassen ist [36]. Tinhofer et al. konnten zeigen, dass EGFR-positive CTCs bei Kopf-Hals-Tumoren unter Cetuximab-Behandlung im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie signifikant reduziert werden konnten [37].

Ein weiterer Hoffnungsträger in der zielgerichteten onkologischen Therapie der HNSCC ist die Checkpoint-Inhibition in Form von PD-1- oder PD-L1-Inhibitoren. Aufgrund der Ergebnisse der CheckMate-141-Studie ist der PD-1-Inhibitor Nivolumab seit 2018 zur Therapie metastasierter Kopf-Hals-Tumoren bei Progress nach Erstlinien-Chemotherapie zugelassen [38, 39]. Die Immuntherapie konnte einen deutlichen Vorteil beim Gesamtüberleben zeigen, allerdings manifestiert sich aufgrund der indirekten Wirkungsweise der Wirkungseintritt meist verzögert. Das kann sich zunächst bildmorphologisch durch fehlende Verminderung der Tumorgröße oder sogar ein scheinbares Größenwachstum (sog. Pseudoprogress) darstellen und wird folglich nicht selten als fehlendes Therapieansprechen (fehl-)interpretiert. Daher sind prädiktive Marker notwendig, die das Ansprechen der kostspieligen Immuntherapie bei Kopf-Hals-Tumorpatienten voraussagen können. Ein möglicher Ansatz wäre die Bestimmung und Quantifizierung der PD-L1-Expression auf CTCs im Blut und Speichel mittels Liquid Biopsy. 

Die Mutationslast des Tumors (engl. Tumor mutational burden, TMB) könnte einen zusätzlichen prädiktiven Biomarker darstellen, um das Ansprechen des Tumors auf eine Immuntherapie vorherzusagen (Abb. 1b). Studien haben gezeigt, dass beispielsweise beim NSCLC eine hohe Tumor-Mutationslast mit besserem Ansprechen auf Immuntherapien assoziiert ist [40]. Weitere Studien, die mittels Liquid Biopsy diesen Sachverhalt bei Kopf-Hals-Tumoren im Allgemeinen untersuchen, fehlen bislang.

Durch vorhergehende genetische Untersuchung des Primärtumors sind tumorspezifische Mutationen bekannt. Diese können anschließend im Verlauf mittels Liquid Biopsy untersucht werden und dem Tumor-Monitoring dienen. Daher spricht man hier vom sogenannten gezielten ctDNA-Screening mit individuellen tumorspezifischen Muta­tionen. 

Hierdurch kann man nicht nur Rezidive früher erkennen, bevor sie sich in der Bildgebung manifestieren, sondern auch Zweittumoren von Rezidiven unterscheiden [18]. Arbeiten von Bettegowda et al. und Wang et al. konnten kürzlich zeigen, dass das Screening spezifischer Mutationen in Plasma und Speichel von HNSCC-Patienten ein sensitiver und spezifischer Ansatz für die Rezidiv-Früherkennung ist [18, 28].

Die Pathogenese des Nasopharynx-Karzinoms ist eng mit EBV assoziiert. EBV-DNA war einer der ersten cfDNA-Biomarker, welcher beim Nasopharynx-Karzinom eingesetzt wurde [7]. Cf-EBV-DNA kann im Plasma mit einer hohen Sensitivität (96%) und Spezifität (93%) detektiert werden [41, 42]. Chan et al. konnten zeigen, dass sich die Detektion von EBV-DNA im Plasma zur Früherkennung asymptomatischer Nasopharynx-Karzinome eignet [8, 43]. Da es sich sowohl bei EBV als auch bei den humanen Papillomviren der High-risk-Gruppe um onkogene Viren handelt, liegt der Gedanke nahe, auch HPV-DNA mittels Liquid Biopsy detektieren zu können.

Der HPV-Status wird in der aktuellen Version der TNM-Klassifikation (Version 8, 12/2016) der Kopf-Hals-Tumoren erstmals zur prognostischen Charakterisierung von Oropharynx-Karzinomen in Form eines immunhistochemischen Nachweises des Tumorsuppressor-Proteins p16INK4a miterfasst. Da HPV-positive Karzinome im Oropharynx trotz häufigerer Metastasierung bei Erstdiagnose eine deutlich bessere Prognose zeigen, werden insbesondere hier aktuell Therapie-Deeskalationen mit dem Ziel einer Minderung der therapieassoziierten Toxizität diskutiert. Hierfür sind Verfahren wünschenswert, die die chirurgische Biopsie-Gewinnung ergänzen können. 

Wang et al. konnten anhand von 93 HNSCC-Patienten zeigen, dass sich somatische Mutationen (TP53, PIK3CA, NOTCH1, FBXW7, CDKN2A, NRAS und HRAS) sowie HPV-DNA (HPV16, 18) im Speichel und im Blut in 76% bzw. in 87% der Fälle detektieren lassen (Tab. 1; [28]). Darunter waren 20 Personen, bei denen sich die Tumorerkrankung im Frühstadium befand. Wurden sowohl Speichel als auch Plasma in Kombination getestet, lag die Gesamt-ctDNA-Detektionsrate unabhängig von der Tumorlokalisation bei 96%. Auch Lokalrezidive konnten in Form von erneutem ctDNA-Nachweis im Speichel detektiert werden.