Nukleinsäure-Extraktion, -Amplifikation und -Detektion: Alle für Einen

Wie die drei Musketiere bilden Nukleinsäure-Extraktion, -Amplifikation und -Detektion zusammen einen zentralen, universellen Prozess, der komplett integriert oder in getrennten Schritten eingesetzt wird – je nachdem, welches Ziel man damit verfolgen will.

In dieser Produktübersicht stellen wir zwei Extraktoren für die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren als isolierten Arbeitsschritt, einen Workflow aus Nukleinsäure-An- und Abreicherung, -Amplifikation und Next Generation Sequencing (NGS) zur Keimidentifizierung sowie eine universelle Software zur Auswertung von qualitativer PCR vor.

Nukleinsäure-Extraktoren

Der rein präanalytische Schritt der Nukleinsäure-Extraktion verläuft in der Regel nach einem Schema aus Zelllyse, Bindung der Nukleinsäuren an ein affines, Festphasen-gebundenes Material und anschließender Elution. Für die Zelllyse werden mechanische, chemische oder enzymatische Verfahren – auch in Kombination – eingesetzt. Die Aufreinigung und Anreicherung der Nukleinsäuren erfolgt in der Regel durch Bindung an eine mineralische Festphase, z. B. Silica-beschichtete Magnetpartikel, wodurch die Ziel-Nukleinsäuren gewaschen und anschließend unter der Verwendung geeigneter Puffer wieder eluiert werden. Dieses Verfahren lässt sich sehr gut auto­matisieren; allerdings muss sorgfältig dekontaminiert werden, um Verunreinigungen mit Fremd-Nukleinsäuren zu vermeiden.
Stand-alone-Geräte, wie wir sie hier vorstellen, kommen in medizinischen Routine-Laboren überwiegend zur Bearbeitung kleiner Serien von besonderen Probenmaterialien, wie z. B. Knochenbiopsien oder Gewebe, zum Einsatz. Die Arbeitsschritte zur Isolierung und Anreicherung der Nukleinsäuren aus solchen Probenmaterialien entsprechen nicht unbedingt dem Standard, sondern müssen für diese optimiert werden. Gleichzeitig ist es sinnvoll, sich für die Routinediagnostik auf bewährte Methoden zu verlassen, was sowohl für die Zelllyse, als auch das Bindungs-/Elutionsverfahren gilt. Genau das trifft auf die beiden hier vorgestellten Geräte zu. Sie verarbeiten kleine Serien von 1 bis 12 bzw. 1 bis 16 Proben und nutzen dabei bewährte Verfahren, wie mit Silica-Gel beschichtete Magnetpartikel oder SpinColumns, die ebenfalls Silica-Gel enthalten und vakuumgetrieben eluiert werden. Wärme kann nach Bedarf zugeschaltet werden.
Beide Extraktoren liefern Eluate für nahezu alle gängigen PCR-Verfahren oder NGS. Von einem Hersteller gibt es CE-IVD-zertifizierte Protokolle für Blut und formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte (FFPE). Für den Forschungseinsatz (Research Use Only, RUO) ist das Spektrum an Probenmaterialien, die verarbeitet werden können, deutlich höher. Isoliert werden neben genomischer DNA, humaner RNA, viraler DNA und RNA, auch zellfreie zirkulierende DNA (cfDNA) und mikroRNA aus dem Blut.
Das zweite Gerät verarbeitet Proben für den gezielten Erregernachweis direkt aus dem Primärmaterial – eine Methode, die den langwierigen, klassisch-mikrobiologischen Prozess der Bestimmung von Erreger und Resistenz deutlich verkürzt. Die Extraktion von bakteriellen oder fungalen Nukleinsäuren aus dem Primärmaterial ohne kulturelle Voranreicherung erfordert ein besonderes Verfahren: Einerseits werden die Ziel-Nukleinsäuren angereichert, andererseits aber gleichzeitig die – in diesem Fall störenden – humanen Nukleinsäuren abgebaut. Als Downstream-Methoden eignen sich PCR und Next Generation Sequencing (NGS).
Der gesamte Prozess verläuft automatisch: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, setzen beide Geräte vorbefüllte Einmalkartuschen ein. Die Bewegungen der Greifarme verlaufen – ebenfalls zur Verhinderung von Kreuzkontaminationen – parallel. Zusätzlich sind beide Geräte mit UV-Lampen zur Dekontamination ausgestattet.
Mithilfe eines Fluorometers wird die Ausbeute an Nukleinsäuren überprüft, eine grundsätzlich wichtige Information, beispielsweise wenn in Downstream-Prozessen wie NGS Eluate gepoolt eingesetzt werden.

Nicht ohne IT

Der automatische Prozess wird elektronisch gesteuert: Bei beiden Geräten erfolgt dies über einen integrierten PC.  So werden sämtliche Arbeitsschritte sowie auch die Reinigung bzw. Dekontamina-
tion nach jedem Lauf und zu fest definierten Terminen überwacht und die Extraktionsergebnisse dokumentiert. Teilweise ist eine Anbindung an ein LIS möglich. Welche Bedeutung eine Software zur Auswertung und Prozessüberwachung hat – besonders auch in Anbetracht der Anforderungen durch Rili-BÄK und Akkreditierung – und dass es hersteller­übergreifende Lösungen dafür gibt, ist auf Seite 170 dargestellt.

Downstream-Anwendungen

Eine bereits etablierte Downstream-Anwendung findet sich in dem auf S. 172 oben dargestellten Workflow zum Erregernachweis, bei dem nach der gezielten Anreicherung und Reinigung eine weitere Amplifikation von bakteriellen oder fungalen Ribonukleinsäuren durch PCR und anschließend eine Sequenzierung durchgeführt wird. Durch Vergleich mit einer Datenbank bekannter Sequenzen erfolgt die Keimidentifizierung.
Weitere Downstream-Applikationen wie beispielsweise die digitale Droplet-PCR (ddPCR) zur Analyse von zellfreier DNA aus der Liquid Biopsy oder zum Nachweis von mikro-RNA werden zurzeit hauptsächlich in der Forschung oder in der Onkologie eingesetzt. Dort bewegt sich z. B. die Untersuchung von Tumor-DNA aus Liquid-Biopsy-Proben in Studien an der Grenze zwischen Routine-Anwendung und Forschung, sodass oft nur sehr kleine Patientengruppen untersucht werden können. Das riesige Potenzial dieser Methoden zeigt sich schon allein in dem Gedanken, dass für die Patienten belastende Operationen vermieden werden können.   

Autor
Dr. Gabriele Egert
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