Volle Kraft voraus Richtung Vollautomation

Die drei oben genannten Herstellerfirmen arbeiten hart daran, den gesamten Prozess der Durchflusszytometrie zu automatisieren. Das aktuelle Zwischenziel besteht darin, die Präanalytik möglichst nahtlos in den gesamten Analyseprozess zu integrieren, sodass die Proben ohne manuelle Zwischenschritte aus dem Primärröhrchen entnommen, dem Analyseprozess zugeführt, gemessen, ausgewertet und ein entsprechender Befundbericht erstellt werden kann – das Endergebnis sollte eine echte Vollautomation sein.
In der Tabelle stellen sowohl BD als auch Beckman Coulter jeweils ein vollautomatisch arbeitendes Durchflusszytometer vor, bei dem der oben skizzierte Workflow erfüllt wird. Die Lösungsansätze sind unterschiedlich und zeigen ein hohes Maß an Flexibilität. Auf der einen Seite lässt sich ein neu entwickeltes Probenvorbereitungssys­tem optional mit dem Zytometer koppeln, sodass ein modulares System entsteht, das eine lückenlose Rückverfolgung der Analysen über die intern erzeugten Sekundärproben bis hin zur Primärprobe garantiert. Auf der anderen Seite steht ein voll inte­griertes System, das über einen Bypass auch manuell mit Proben beladen werden kann.
Damit die Vielzahl unterschiedlicher Primärröhrchen nicht zum Handicap wird, stellen die Hersteller darüber hinaus unterschiedliche Adapter zur Verfügung, in welche die Primärröhrchen eingesetzt werden können. Auch ein Probenrack für pädiatrische Proben ist bei einem der Geräte vorhanden. Die Deckel der Primär­röhrchen werden durchstochen (Cap Piercing), um die Probe zu entnehmen.

Tabellarische Übersicht: Durchflusszytometer für den Hochdurchsatz

Die eigentliche Messung

Die drei in der Tabelle vorgestellten CE-IVD-zertifizierten Zytometer sind mit ein bis drei Lasern und der entsprechenden Zahl an Anregungswellenlängen ausgestattet. Sie erfassen mit ihren Detektoren (Photomultiplier-Tubes, Fotodioden) die Streulichtsignale von Partikeln (Zellen) in einem linearen Messbereich von 4 bis 6 log-Stufen, was einer Größenordnung der Partikel zwischen drei bis fünfzig µm entspricht. Die Detektionsgrenze liegt tatsächlich noch etwas tiefer, bei 200 nm, und eine der RUO-Plattformen unter Verwendung eines Violet Side Scatter sogar bei 80 nm für Polystyrol-Partikel.
Ein breiter linearer Messbereich ist von großem Vorteil, weil in der Praxis dann unterschiedliche Zellen sicher erfasst werden können, ohne die Geräteeinstellungen zu verändern.
Die Detektoren sind außerdem in der Lage, vier bis vierzehn unterschiedliche Fluoreszenzsignale zu erfassen, sodass mithilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper verschiedene Lymphozyten-Subtypen gleichzeitig differenziert werden können, eine wichtige Eigenschaft für die Leukämie- und Lymphom-Diagnostik.

Auswertung und Prozesssteuerung

Mitentscheidend für die Analytik ist die Software zur Auswertung der gemessenen Streulicht-Dotplots. Denn nach der Messung können die Auswertungen so aufbereitet werden, dass sie nur die für bestimmte Fragestellungen relevanten Dotplots einblenden, das sogenannte Gating. So gibt es beispielsweise Gating-Algorithmen speziell für die Darstellung des Immunstatus, aber natürlich auch für andere Fragestellungen.
Nicht nur die Auswertung, sondern auch die Prozesssteuerung, etwa die Verwaltung und Auswertung der Rili-BÄK-konformen Qualitätskontrolle oder die Reinigungs- und Wartungsschritte der Geräte sind IT-gesteuert.

Assays für Diagnostik und Therapie

Zu den Assays, die zum festen Bestandteil der Diagnostik und Therapie bestimmter Erkrankungen geworden sind, zählen die Bestimmung des Immunstatus bei angeborenen bzw. sekundären Immundefekten. Die Diagnostik angeborener Immundefekte betrifft meist pädiatrische Patienten; ein klassisches Beispiel für einen sekundären, also erworbenen Immundefekt ist die HIV-Infektion. Hierbei geht es darum, mithilfe der Durchflusszytometrie zu Beginn und auch während des Therapieverlaufs Aussagen zur Medikamentendosierung zu treffen. Auch bei einer immunmodulierenden Chemotherapie, z. B. B-Zell-Depletion mit Rituximab, kann es sinnvoll sein, den Immunstatus – und damit das Stadium der Immunsuppression eines Patienten – zu überwachen.
Weitere Anwendungsgebiete in der medizinischen Routinediagnostik sind die Differenzierung von Leukämien und Lymphomen, wieder anhand von Leukozyten-Subtypen, oder die Bestimmung des CD4/CD8-Quotienten aus der broncheo­alveolären Lavage (BAL) zur Unterscheidung zwischen einer Allergie und Sarkoidose.

Ausblick

Eine der ersten Anwendungen für die Durchflusszytometrie bestand im Sortieren und Quantifizieren von Zellen oder fluoreszenzmarkierten Biomolekülen, wie z. B. Zytokinen. Das ist auch heute noch eine ihrer Aufgaben, die aber eine andere Gerätekonfiguration erfordert als die reine Analytik. Mittlerweile gibt es für die Sortierung von Zellen kleine Durchflusszytometer, die auf einem (Einmal)-Mikrofluidik-Chip basieren. Eine neue Herausforderung besteht jetzt darin, die Sortierfunktion der Zytometer mit der Analytikfunktion zu kombinieren, um für noch enger eingegrenzte Subpopulationen von Zellen noch tiefgreifendere Informationen zu erhalten. Ein Anwendungsbeispiel ist die Expression von Zytokinen. Untersuchungen zur Apoptose oder extrazellulären Vesikeln, all das zählt aktuell noch zu den Forschungsfragestellungen, die im Rahmen der personalisierten Medizin auf immer stärkeres Interesse stoßen werden. Die Durchflusszytometrie wird uns noch helfen, eine ganze Reihe von offenen Fragen zu beantworten.

Dr. Gabriele Egert
Prof. Dr. Rudolf Gruber

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