Große Zukunft für kleine Biomarker

MicroRNAs

MicroRNAs spielen eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle wichtiger zellulärer Funktionen. Sie zeichnen sich durch hohe Stabilität aus und können z. B. durch quantitative PCR oder Next Generation Sequencing leicht im Blut oder anderen Bioflüssigkeiten nachgewiesen werden. Aufgrund ihrer Gewebespezifität und ihrer Bedeutung als Regulatoren der Thrombozytenfunktion ergeben sich vielversprechende Ansätze für die Verwendung als Biomarker in der Kardiologie

Schlüsselwörter: miRNA, Hämostase, Mikropartikel, Thrombose, koronare Gefäßerkrankung, Herzinfarkt

MicroRNAs (miRNAs) wurden erstmals 1993 im Fadenwurm Caenorhabditis elegans beschrieben [1]. Ihre Aufgabe ist die Regulation der Genexpression ­– beim Menschen steht die Expression von mindestens 70% der protein-kodierenden Gene unter ihrer Kontrolle. Als Teil eines Proteinkomplexes (RISC) beschleunigen miRNAs den Abbau von Messenger-RNA (mRNA) und hemmen deren Übersetzung (Translation) in Proteine. Dieser Mechanismus gleicht jenem der Small Interfering RNAs (siRNAs), welche zur Hemmung von spezifischen Genen auch therapeutisch eingesetzt werden. Im Gegensatz zu ­siRNAs können einzelne miRNAs jedoch hunderte von unterschiedlichen mRNAs binden und regulieren. Dies ermöglicht miRNAs die Steuerung von Genexpressionsmustern statt einzelner Zielgene, und somit die Kontrolle wichtiger zellulärer Funktionen. Sie beeinflussen auf diese Weise auch die Entstehung verschiedener Krankheiten [2].
Die Transkription von miRNAs ist zum Teil zelltyp- sowie gewebespezifisch und eng mit benachbarten Genen organisiert. Zellen geben einen Teil der intrazellulär gebildeten miRNAs in Form von extrazellulären Vesikeln (Mikrovesikeln, Exosomen) [3, 4] sowie an Proteinkomplexe (z. B. HDL) [5] gebunden in ihre Umgebung ab. Dies ermöglicht die Detektion von miRNA im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten.
Aus analytischer Sicht ist hervorzuheben, dass miRNAs durch die Verpackung in Vesikeln, die Bindung an Lipoproteine sowie die geringe Kettenlänge von nur 22 Nukleotiden vor dem Angriff endogener RNAsen gut geschützt sind (Abb. 1). In humanen Plasmaproben sind sie zudem weitaus resistenter gegenüber Temperaturschwankungen oder mehrmaligen Einfrier-Auftau-Zyklen als viele analytisch genutzte Proteine [6].

miRNAs als Biomarker

Die genauen Mechanismen der Freisetzung und die Funktion von extrazellulären miRNAs sind noch nicht vollständig geklärt, aber die Datenlage lässt vermuten, dass zirkulierende miRNAs von anderen Zellen aufgenommen werden können, und damit Bestandteil einer neuen Art von Zell-Zell-Kommunikationssystemen sind [7]. Die Tatsache, dass miRNAs ins Blut freigesetzt werden, kann man nutzen, um anhand von Veränderungen der miRNA-Profile im Blut Hinweise auf zelluläre und Gewebefunktionen sowie insbesondere auf Schädigungen bestimmter Zelltypen zu erhalten.
Für den Einsatz als Biomarker bringen miRNAs mehrere wichtige Vorteile mit:
hohe Stabilität in tiefgefrorenen Proben für retrospektive Analysen
einfacher, skalierbarer und schneller Nachweis mit etablierten Methoden für die Detektion und Quantifikation von Nukleinsäuren (quantitative PCR, Next Generation Sequencing)
Nachweis in leicht zugänglichen Bioflüssigkeiten wie Plasma, Serum, Urin, Speichel und Tränenflüssigkeit [8]
hohe Gewebespezifität einzelner miRNAs ermöglicht Feststellung des Ursprungs zirkulierender miRNAs und somit zelltypspezifische Detektion von Gewebeschäden

Regulation der Thrombozytenfunktion

Thrombozyten spielen eine Schlüsselrolle in der Hämostase [9]. Dysregulation und fehlerhafte Aktivierung von Thrombozyten stehen mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Zusammenhang, darunter Thrombosen, Schlaganfall und Herzinfarkt auf der einen sowie Gerinnungsstörungen auf der anderen Seite. Trotz der Bezeichnung sind Thrombozyten keine Zellen im eigentlichen Sinn, sondern kernlose Zellfragmente, die von Mega­karyozyten (MK) aus dem Knochenmark abgeschnürt und ins Blut abgegeben werden.
Thrombozyten übernehmen von den parentalen MK Proteine, mRNAs und die subzelluläre Maschinerie für die De-novo-Proteinsynthese [10]. Zusätzlich enthalten sie ganz bestimmte miRNAs in hoher Konzentration [11], welche in der Lage sind, die Funktion von Thrombozyten zu regulieren [12]. Darüber hinaus führt die Aktivierung von Thrombozyten zu einer Freisetzung von miRNA-haltigen Mikrovesikeln, sodass die Plasmaspiegel thrombozytärer miRNAs als Biomarker der Thrombozytenfunktion dienen können [13]. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind zum Teil bekannt. So  reguliert miR-126-3p die Thrombozytenreaktivität über die Kontrolle von ADAM9, einer Metalloprotease, welche die kollageninduzierte Thrombozytenaggregation beeinflusst [14]. Des Weiteren steuert miR-223-3p die Expression des ADP-Rezeptors P2Y12, der für die ADP-vermittelte Aktivierung von Thrombozyten verantwortlich ist und die molekulare Zielstruktur für bestimmte antithrombozytäre Medikamente darstellt [15].
Extrazelluläre Vesikel (EV) aus Thrombozyten sind der am häufigsten vorkommende Subtyp im Kreislaufsystem und enthalten große Mengen an miRNAs [16]. Sie vermitteln den miRNA-Transfer zu anderen Zellen des Kreislaufsystems und regulieren die Genexpression von Empfängerzellen sowie deren Funktion [17, 18]. Unter Berücksichtigung ihrer entzündungshemmenden Eigenschaften ist es sehr wahrscheinlich, dass Thrombozyten-EV und ihre miRNAs sowohl akut als auch chronisch an kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind [19]. Die Menge an Thrombozyten-EV und die darin enthaltenen miRNA-Profile in der Zirkulation könnten somit als Surrogat für die Thrombozytenfunktion und Reaktivität dienen (Tab. 1).

miRNA-IDThrombozyten-FunktionZellulärer UrsprungValidierte Pathways/Zielgene
hsa-miR-126-3pThrombozytenaktivierungThrombozyten, Megakaryozyten und EndothelzellenVEGF-Signalweg: SPRED1 und PIK3R2/p85-β↓ Gefäßentzündungsreaktionen: VCAM-1 ↓
hsa-miR-223-3pAggregation und GranulaSekretionThrombozyten und Megakaryozyten P2Y12-Rezeptor↓, RPS6K1/HIF-1a Signalweg   
hsa-miR-197-3pThrombozytenaktivierungThrombozyten 
hsa-miR-191-5pThrombozytenaktivierungThrombozyten und Endothelzellen 
hsa-miR-150-5pThrombozytenaktivierung und Megakaryopoese Leukozyten, Megakaryozyten und Monozytenc-Myb, VEGF-a, HIF-1a

Tab. 1: Überblick über miRNA-Biomarker für die Thrombozytenfunktion

Verwendung in der Dia­gnostik

Fehlerhafte Thrombozytenaktivierung spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen. So gibt eine randomisierte multizen­trische, in 33 europäischen Ländern durchgeführte Studie (TROPICAL-ACS) erste Hinweise auf die Vorteile einer personalisierten Antithrombosetherapie für Patienten mit akuter koronarer Herzkrankheit [20]. Leider gibt es noch keine allgemein akzeptierten Parameter und Entscheidungsgrenzen für die Thrombozytenaktivität, deren Abweichungen den Zustand eines hohen Risikos für kardiovaskuläre Erkrankungen anzeigen könnten; hier sind Forschungs- und Routinelaboratorien gefordert, Grundlagenarbeit zu leisten. Zudem besteht Bedarf an schnellen und einfachen Methoden, um die Wirksamkeit von medikamentöser Thrombozyten-Aggregationshemmung zu überwachen, und damit Antithrombosetherapien individuell maßzuschneidern [21].
Thrombozyten-spezifische miRNAs (thrombo-miRNAs) im Plasma könnten als neuartige pharmakodynamische Bio­marker für Thrombozytenaktivierung und koronare Herzkrankheit herangezogen werden [22]. Eine Studie von Willeit und Zampetaki zeigte, dass thrombo-miRNAs im Plasma sowohl von gesunden als auch erkrankten Personen unter Antithrombosetherapie signifikant abnehmen [19]. Bei gesunden Probanden beeinflusste eine verlängerte Thrombosehemmung über vier Wochen die Spiegel der miRNAs im Plasma und führte zu einer Abnahme von beispielsweise miR-126-3p, miR-150-5p, miR-191-5p und miR-223-3p. Außerdem wurde gezeigt, dass der Wechsel von der dualen Inhibierung mit Clopidogrel und Aspirin zum stärker wirksamen Ticagrelor mit einer signifikanten Reduktion thrombozytärer miRNAs im Plasma verbunden ist [16]. Im Gegensatz dazu waren erhöhte Serumspiegel thrombozytärer miRNAs, insbesondere miR-197-5p und miR-223-3p, mit erhöhter Mortalität einer Kohorte von 873 Patienten mit symptomatischer koronarer Gefäßerkrankung assoziiert [23]. Autoren der populations-basierten Bruneck-Studie konnten zeigen, dass auch die thrombozytäre miR-126-3p Teil einer Signatur ist, die mit der Inzidenz von Herzinfarkten in der Allgemeinbevölkerung korreliert [24].
Neben der Verwendung als Biomarker für die Thrombozytenfunktion und Risikostratifizierung umfassen weitere klinische Anwendungen von miRNAs die Differenzialdiagnose von Brustschmerzen, sowie die Risikoklassifizierung bei kardialen Ereignissen. Eine Reihe von Studien zeigt, dass die Muskel-spezifischen miRNAs miR-1-3p und miR-133a in Patienten mit Angina Pectoris und Herzinfarkt erhöht sind [25]. Weiterhin sind miRNA-126-3p und miRNA-485-3p im Vergleich zu Patienten mit anderen Ursachen für Schmerzen im Brustbereich nur bei Angina Pectoris erhöht, während miRNA-499-5p spezifisch für Myokardschäden bei Herzinfarkt zu sein scheint [25,26].
Ein weiteres vielversprechendes Einsatzgebiet von miRNA-Biomarkern ist die Diagnose von chronischen oder akuten Schädigungen der Leber. Sowohl die Spezifität als auch die Empfindlichkeit der in der Routine verfügbaren Marker (Alanin­aminotransferase (ALT) und Aspartat­aminotransferase (AST)) ist für manche Anwendungen begrenzt, da gezeigt wurde, dass die Korrelation zwischen Leberenzym­veränderungen und beobachtbaren histopathologischen Schäden gering ist [27]. Darüber hinaus spiegelt der erhöhte Serumlevel von ALT, die häufig als Biomarker für hepatozelluläre Verletzungen verwendet wird, auch Muskelverletzungen wider. Daher besteht klinischer Bedarf an sensitiveren und spezifischeren Biomarkern für eine bessere Diagnose und Prognose von Leberfunktion und -erkrankungen. Bestimmte miRNAs, z. B. miR-122-5p und miR-192-5p, werden selektiv in Hepatozyten gebildet. Bei akuten oder chronischen Schädigungen der Leber zeigen beide miRNAs dosis- und expositionsdauerabhängige Änderungen im Plasma, die parallel zu den Serumaminotransferase-Spiegeln und der Histopathologie der Leberentartung liegen [28]. In einer Studie an Menschen- und Mäusemodellen wurde außerdem gezeigt, dass Plasmalevel von miR-122-5p ein zuverlässiger Biomarker für die Diagnose und Prognose von Leberschäden, welche durch Viren, Alkohol und Chemikalien hervorgerufen werden, sein könnten [29]. Und erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Kombination von miR-122, miR-192 und miR-151a eine genauere Prognose über das Risiko postoperativer Leberdysfunktion bei Teilresektionen geben können, als ALT, AST und ICG Clearance [30]. Darüber hinaus wurde auch miR-103a-3p als geeigneter Biomarker unter den zirkulierenden miRNAs beschrieben, die bei Ratten mit Acetaminophen-induzierter Hepatotoxizität identifiziert wurden [31].

Fazit

Die translationale und klinische Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass die Gewebespezifität bestimmter ­miRNAs in Kombination mit ihrer biologischen Funktion vielversprechende Anwendungen als Biomarker in der Kardiologie ermöglichen. Hervorzuheben ist dabei ihre hohe Stabilität im Probenmaterial sowie die einfache Standardisierung der prä-analytischen und analytischen Verfahren, speziell auch für thrombozytäre miRNAs im Serum und Plasma [32]. Es ist zu erwarten, dass diese Analyten in absehbarer Zeit mächtige Werkzeuge für klinische Studien sowie – in Kombination mit etablierten Biomarkern – für die Früherkennung und Prognose kardialer Ereignisse sein werden.     

Autoren
Elisabeth Schraml, PhD
TAmiRNA GmbH
Dr. rer. nat. Matthias Hackl
TAmiRNA GmbH