Nicht nur was für Onkologen!

Liquid Biopsy

Die Liquid Biopsy hat in den letzten Jahren im Kontext der personalisierten Medizin nicht nur in die Onkologie Einzug gehalten, sondern findet bereits auch in vielen weiteren Bereichen in der Diagnostik ihre Anwendung. So wird sie beispielsweise bereits in der pränatalen Diagnostik als Screeningtest für Trisomie 21 eingesetzt; in der Kardiologie können miRNAs u. a. als neue Prognosemarker bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen dienen.

Schlüsselwörter:  Flüssigbiopsie, Nukleinsäurenachweis, CTC, ctDNA, cfDNA, miRNA, Exosomen, ddPCR, NGS

Eine frühzeitige Diagnostik kann den Verlauf von Erkrankungen sowie das Outcome der Patienten – insbesondere bei Tumorerkrankungen – entscheidend beeinflussen. Hier gilt die Tumorgewebebiopsie als Goldstandard zur Klassifizierung des Subtyps; jedoch stellt sie nur eine Momentaufnahme dar und die Materialgewinnung durch Nadelbiopsie kann insbesondere bei Lungen- und Hirntumoren mit Komplikationen einhergehen oder sogar unmöglich sein. Die molekulare Entwicklung der Tumoren muss aber zeitnah und in kurzen Intervallen verfolgt werden, um entstehende Resistenzen gegen die verwendeten Therapien frühzeitig zu erkennen, und durch einen rechtzeitigen Therapie-„Switch“ das Überleben deutlich zu verbessern.
Die Liquid Biopsy („Flüssigbiopsie“) sorgt seit mehreren Jahren für Begeisterung in der Medizin, insbesondere bei den Onkologen. Hierbei handelt es sich um die blutbasierte Nukleinsäureanalytik zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) bzw. freier Tumor-DNA (ctDNA), sowie molekularer Marker in extrazellulären Vesikeln (EV) und Thrombozyten (Tumor-Educated Platelets) im Blut, die in Zusammenhang mit der Tumorentstehung und dessen Wachstum sowie Metastasierung stehen [1]. Molekulare Marker können auch in anderen Körperflüssigkeiten wie Urin, Speichel, Bronchiallavage, Liquor etc. detektiert werden [2]. 
Da die genannten Marker im Blut nur in geringen Mengen vorkommen, ist erst durch die Etablierung neuer Verfahren und hochsensitiver Techniken, wie der „digital droplet PCR“ (ddPCR) oder dem „Next Generation Sequencing“ (NGS), ein Nachweis möglich geworden.
Unter dem Schlagwort „Liquid Biopsy“ wurden in Pubmed im Februar 2019 mehr als 4.500 wissenschaftliche Arbeiten und Abstracts gelistet. In der Mehrheit handelt es sich dabei um Anwendungen in der Onkologie. Hier stehen insbesondere Tumoren der Lunge, epitheliale Tumoren der Haut, der Brust und des GI-Traktes inklusive des Colons im Fokus [3], da ctDNA vor allem bei metastasierten Tumorerkrankungen nachweisbar ist [4].
Auch zwischen den Tumortypen und in Abhängigkeit vom Tumorstadium existieren große Unterschiede. So ist in fortgeschrittenen Darm- oder Eierstockkarzinomen in fast 100% der Fälle ctDNA nachweisbar, hingegen ist die Frequenz im Prostata- und Nierenkarzinom auch bei Metastasierung mit 40% vergleichsweise niedrig.

Pränatale Diagnostik

Aber auch jenseits der Onkologie wird der blutbasierte Nachweis von geringen Mengen vorhandener Ziel-DNA vor dem Hintergrund massiv vorhandener Wildtyp-DNA bereits seit einigen Jahren angewendet: Zu den ersten kommerziellen Anwendungen gehörte der Nachweis zellfreier fetaler DNA (cffDNA) im mütterlichen Blut als Screeningtest auf Trisomie 13, 18 und 21, da 10–15% der DNA im Blut einer Schwangeren aus der Plazenta stammen, die dem Fötus genetisch ähnlich ist (nicht invasiver pränataler Test NIPT). Diese Detektion mittels DANSR-Assay (Digital Analysis of Selected Regions) ist dem bisherigen Ersttrimester-Screening auf  Trisomie 21 deutlich überlegen (Sensitivität 100%; 95%-KI 90,7–100 vs. Sensitivität 78,9%; KI 62,7–90,4) [5–7]. Wesentlich ist jedoch die hohe Spezifität des neuen Verfahrens, um die Rate an falsch-positiven Befunden – und damit die Notwendigkeit einer Amniozentese bzw. einer Chorionzottenbiopsie – zu reduzieren, die mit einer signifikanten Erhöhung der Infektionsrate und kindlichen Mortalität einhergeht.
Im weitesten Sinne gehört auch das aktuell in die Kinderrichtlinie aufgenommene Screening von Neugeborenen zur Früherkennung von schweren kombinierten Immundefekten (SCID) dazu. Mittels PCR können hier T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) und bei Bestimmung der B-Zell-Defizienz Kappa-deleting Recombination Excision Circles (KREC) quantifiziert werden. TREC und KREC sind kleine ringförmige DNA-Fragmente, die bei der Biosynthese des T- beziehungsweise B-Zell-Rezeptors als Abfallprodukte entstehen, und deren Anzahl im Blut mit der Zahl frisch entstehender naiver T- beziehungsweise B-Zellen korreliert [8].

Liquid Biopsy beyond Cancer

Es ist daher nachvollziehbar, dass die rasante Entwicklung der Technologien konsequenterweise auch bei den großen Zivilisationserkrankungen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes mellitus, Anwendung finden könnte. Die klassische Methode der laborchemischen Detektion von Erkrankungen mittels Bio­markern, Proteinen, Enzymen etc. hinkt dem Anspruch der „precision medicine“ bzw. dem Konzept der personalisierten Medizin der Onkologie aber noch hinterher. Mit einfachen Worten: cfDNA, mRNA, miRNA könnten zum ultimativen „molekularen Stethoskop“ werden, das eine völlig neue Art der Diagnostik und Therapie ermöglicht – ähnlich wie das akustische Stethoskop nach seiner Einführung im 19. Jahrhundert, das für immer die diagnostischen Möglichkeiten veränderte (Tab .1).
Limitierend für die routinemäßige Nutzung sind derzeit noch die Probleme bei der Aufarbeitung des Probenmaterials zur Gewinnung der frei-zirkulierenden oder in Vesikeln verpackten molekularen Biomarker. Die Reinheit des Prüfmaterials und die Konzentration der Biomarker wird durch zahlreiche präanalytische und methodische Faktoren maßgeblich beeinflusst, ist jedoch Grundvoraussetzung für die Validität der Ergebnisse. Es existieren verschiedene Methoden zur Isolierung von cfDNA (z. B. magnetische Separation bzw. Filtration) mit unterschiedlichen Anforderungen an die Blutentnahme selbst und den Probentransport (z. B. Verwendung verschiedener Stabilisatoren). Ein kritischer Punkt ist hierbei die Vermeidung eines Zellzerfalls in vitro, der die Konzentrationsverhältnisse von Wildtyp und Ziel-DNA massiv verändern kann, mit nachfolgenden Einschränkungen für die Detektion der Ziel-DNA (falsch-negative Ergebnisse bzw. unterhalb der Nachweisgrenze).

Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Auf der Suche nach geeigneten Biomarkern fokussiert sich die Datenlage bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf die Analyse von extrazellulären Vesikeln (EVs) wie Exosomen (EXOs). Die 40–150 nm großen EXOs haben ihren Ursprung in diversen subzellulären Kompartimenten und werden von diesen in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die EXOs lassen sich aus den unterschiedlichsten Körperflüssigkeiten isolieren und sind aus analytischer Sicht stabil (Kryokonservierung). Nachteil ist jedoch weiterhin die nicht ausreichende Standardisierung der aufwendigen Methoden zur Isolierung funktionell intakter EXOs (z. B. differenzielle Ultrazentrifugation, immunomagnetische Methoden). Als bioaktive Moleküle transferieren sie ihren Inhalt zu den Zielzellen bzw. -geweben und wirken als Regulatoren der interzellulären Kommunikation zwischen verschiedenen Zellpopulationen mit dem Ziel, die Gewebehomöostase zu erhalten und die adaptive Reaktion auf Stress zu koordinieren. Da der Vesikelaufbau und der biologische Inhalt wie z. B. DNA, mRNAs, miRNAs und Proteine die spezifische Signatur der Zellen tragen, können diese ein Konzept sein, eine frühzeitigere Diagnose der sogenannten Zivilisationsseuchen zu ermöglichen und damit vor allen Dingen das Outcome der Patienten zu verbessern.
Diese Art der interzellulären Kommunikation ist insbesondere im Herz-Kreislauf-Bereich wesentlich, da das Herz ein komplexes multizelluläres System ist. Es konnte gezeigt werden, dass Stressbedingungen wie Hypoxie oder Entzündung den Inhalt der EXOs und ihre Freisetzung modulieren [9]. Der spezifische Nachweis typischer Myokardzellenproteine in EXOs wie Caveolin-3 erlaubt eine eindeutige Zuordnung. Die am häufigsten untersuchten Marker aus EXOs sind miRNAs (non-coding microRNA), die eine hohe Stabilität aufweisen und die posttranskriptionelle Genexpression in Zielzellen regulieren.  
Mehrere Untersuchungen zeigten eine erhöhte Freisetzung von miRNAs bei akutem Koronarsyndrom (ACS). Insbesondere 4 miRNAs (miR-1, miR133a/b, miR-208a, miR-499) werden in diesem Zusammenhang diskutiert. Bei Patienten mit ACS konnten die aus den Kardiomyozyten freigesetzten miRNAs früher im Blut detektiert werden als kardiales Troponin (< 4 h nach Myokardinfarkt). Diese Ergebnisse zeigen das große Potenzial dieser miRNAs als frühestmögliche kardiale Biomarker zur Diagnose eines ACS [10]. Gidlöf et al. konnten zeigen, dass erhöhte Level von has-miR-208b und hsa-miR-499-5p als Prognosemarker für Mortalität und Herzinsuffizienz geeignet sein könnten. Neben dem diagnostischen Einsatz von EXOs werden derzeit auch therapeutische Ansätze unter Verwendung von zielgerichteten Exosomen verfolgt. Dabei werden zwei große Kategorien unterteilt: diejenigen, die den negativen Funktionen schädlicher EXOs entgegenwirken, und jene, die die kardioprotektive Wirkung von nützlichen EXOs nutzen und verbessern.

 

(Mögliche)AnwendungsgebieteMaterial/BiomarkerPotenzialQuelle
Kardiovaskuläre ErkrankungenBlut, zellspezifische Exosomen (EXOs), miRNA-Profile und Proteinprofile der EXOsDiagnostik und Therapie unter Einsatz von ExosomenBellin et al., 2019
Diabetische mikro-/makro-vaskuläre KomplikationenBlut und Urin, miRNA und Exosomenfrühe (präklinische) Diagnostik DM-assoziierter Schäden (z. B. Nephro-pathie, Hyperkoagulabilität)La Marca und Fierabracci, 2017
Nicht-alkoholische Fettleber­erkrankung (NAFLD)Blut, zirkulierende extra-zelluläre miRNAfrühe nicht-invasive DiagnostikTurchinovich et al., 2018
Pränataldiagnostik (NIPT)Blut, cfDNAnicht-invasive Diagnostik

Harasim et al., 2016

 

 

 

 

Tab. 1: Andere Indikationen und mögliche Anwendungsgebiete für Liquid Biopsy.

Fazit

Angesichts der umfangreichen Datenlage zu den verschiedenen Erkrankungen und der verwendeten molekularen Biomarker in verschiedensten Körperflüssigkeiten kann hier nur exemplarisch auf die derzeitigen Entwicklungen eingegangen werden. Um valide Aussagen treffen zu können, ist die Reproduzierbarkeit vorhandener Ergebnisse entscheidend. Wesentlich ist dabei die Standardisierung der Methodik der Probenaufarbeitung und Analytik, um dann eine sichere, routinetaugliche, individuelle Diagnostik zu ermöglichen und damit den Patienten den Zugang zu maßgeschneiderten Therapien zu gewähren.
Es wird sehr spannend zu erleben, wie das Anwendungspotenzial der Liquid-Biopsy-Diagnostik in den nächsten Jahren weiter wächst.   

Autoren
Dr. med. Katrin Borucki
Prof. Dr. med. Berend Isermann
Dr. rer. nat. Juliane Hoffmann
Institut für Klinische Chemie und Pathobiochemie
Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg