Schnelle Identifizierung und Differenzierung

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

In den letzten zwei Dekaden wurde die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Differenzierung und Charakterisierung von Bakterien, Pilzen und Viren in die mikrobiologische Diagnostik eingeführt. Bestimmte Resistenzmerkmale lassen sich damit ebenfalls nachweisen.

MALDI-TOF ist unter Mikrobiologen heute zu einem der am häufigsten diskutierten Schlagwörter geworden, wenn es um die technologische Weiterentwicklung des Fachs geht. Das Kürzel steht für matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight, beschreibt also einen „Flugzeit-Analysator“ für ionisierte Moleküle, zum Beispiel Peptide, Lipide, Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren. Das Grundprinzip ist die Erzeugung geladener Moleküle aus einem Analyt-Matrix-Gemisch mithilfe eines gepulsten Laserstahls, wobei Protonen der Matrix auf den zu untersuchenden Analyten transferiert werden. Die so entstandenen Ionen werden in einem evakuierten Rohr durch ein elektrisches Feld beschleunigt und durchfliegen eine feldfreie Driftstrecke. Aufgrund des definierten elektrischen Feldes treten alle Ionen mit der gleichen kinetischen Energie in die Driftstrecke ein und teilen sich entsprechend ihres Verhältnisses von Masse zu Ladung (ratio m/z) räumlich auf, bevor sie auf einen Detektor treffen. Aufgrund der Ladung und der benötigten Flugzeit kann dann das Massen-Ladungs-Verhältnis berechnet und in einem Diagramm grafisch in Form von Peaks dargestellt werden.
1975 wurde die erste Beschreibung des Einsatzes der Massenspektrometrie zur Identifizierung von Bakterien auf Basis ihres Proteinmusters veröffentlicht. In den 1990er-Jahren kam die Technologie in der mikrobiologischen Forschung zum Einsatz und 2004 wurde die erste komplette Datenbank mit Referenzspektren zur Identifizierung von Bakterien in der diagnostischen Routine vorgestellt. Mittlerweile sind zwei verschiedene Systeme, der VITEK® MS von bioMérieux (s. hier) und der MALDI Biotyper von Bruker, verfügbar. Beide Systeme stellen eine kosteneffektive Alternative zu konventio­nellen Kulturverfahren wie auch den molekularbiologischen Methoden dar.

Vor- und Nachteile
Der große Vorteil von MALDI-TOF-MS liegt in der Verwendung eines einzigen analytischen Geräts, das zur Differenzierung von Bakterien und Pilzen genutzt werden kann. Die Ergebnisse können dem Kliniker schon am ersten Tag der Materialablesung (12 bis 24 Stunden nach Probeneingang) als Vorbefunde mitgeteilt werden. Ein weiterer, vor allem für die Forschung bedeutsamer Vorteil liegt darin, dass neue Protein-Referenzspektren jederzeit in die Datenbank eingelesen werden können; für den klinischen Einsatz ist allerdings eine strenge Kontrolle erforderlich, die sicherstellt, dass nur sorgfältig validierte Spektren in die Datenbank einfließen.
In der Bakteriologie weist man mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ribosomale Proteinsequenzen nach, die in der Regel eine gute Differenzierung ermöglichen. Bei phylogenetisch sehr eng verwandten Gattungen kann die Differenzierung allerdings erschwert sein; das gilt zum Beispiel für die Unterscheidung zwischen Shigella spp. und E. coli oder innerhalb der Viridans-Streptococci (S. anginosus/mitis-Gruppe). Eine ähnliche Problematik begegnet uns auch bei der Analyse von 16S rDNA-Sequenzen dieser Spezies.
Andererseits ist die Massenspektrometrie im Vergleich zu kulturellen Verfahren bei Verlust oder Zugewinn von Stoffwechseleigenschaften der Erreger nicht beeinträchtigt – einer typischen Einschränkung der herkömmlichen biochemischen Spezies­differenzierung. Beim Vergleich von klassischer mit molekularer oder MALDI-TOF-basierter Erreger-Differenzierung können durchaus diskordante Ergebnisse auftreten.

Direktnachweis

Eine technische Limitierung der massenspektrometrischen Methode besteht schließlich darin, dass die Patientenproben nicht ohne weiteres direkt für die Differenzierung eingesetzt werden können. Haupthindernis war bisher die Überlagerung von Spektren ribosomaler Proteine bei gleichzeitigem Vorliegen mehrerer Bakterienarten oder auch durch Proteine aus humanen Zellen. In den letzten Jahren wurden allerdings Protokolle zum Direktnachweis und zur Differenzierung von Erregern aus nativen Urinproben oder positiven Blutkulturen etabliert und validiert. Bei beiden Materialien ist die Beeinträchtigung durch Fremdproteine entweder primär gering (Urin) oder durch Zelllyse und Waschung relativ einfach zu reduzieren (Blutkultur). Im Spektrum niedriger Massenbereiche erfährt MALDI-TOF-MS zudem eine gewisse Einschränkung durch zu leichte Verdampfbarkeit im Vakuum und zu große Interferenz mit Matrix-Signalen, die eine zuverlässige Charakterisierung erschweren.

Resistenznachweis

Aufgrund der weltweiten Zunahme und Verbreitung von multiresistenten Gram-negativen Bakterien (MRGN) fokussieren sich mehrere Arbeitsgruppen auf den Nachweis von Betalaktamasen bzw. Carbapenemasen in Gram-negativen Bakterien mithilfe eines MALDI-TOF-MS-basierten Hydrolyse-Assays. Im Gegensatz zu Kulturverfahren oder molekulargenetischen Tests erfolgt hier also ein funktioneller Nachweis der enzymatischen Aktivität, indem zum Beispiel Abbauprodukte des jeweiligen Antibiotikums im Bereich von 100 bis 800 m/z beobachtet werden. Ebenfalls im Zusammenhang mit MRGN konnte diese Technologie zur epidemiologischen Untersuchung von „MRGN-Ausbrüchen“ eingesetzt werden. Hiermit war es möglich zu zeigen, dass sich unterschiedliche Klone einer Spezies mit MSP-Dendrogrammen differenzieren lassen.

Ausblick

Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist mittlerweile in der mikrobiologischen Routine angekommen und hat noch erhebliches Erweiterungspotenzial. Zu nennen sind hier vor allem die einfache und zeitnahe Typisierung von MRSA-und ESBL-Stämmen sowie die Charakterisierung von eukaryotischen Einzellern wie Plasmodien und Cryptosporidien.    


Priv.-Doz. Dr. med. Beniam Ghebremedhin

Helios Klinikum Wuppertal

 


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