Molekulardiagnostik

Molekulardiagnostik

Kleine Geräte mit großer Leistung

Auch nach über 30 Jahren gibt es im PCR-Labor noch methodische Weiterentwicklungen und Verbesserungen im Bereich der Automation. Alternative isotherme Verfahren vergrößern das Angebot. Wir stellen fünf verschiedene Tischgeräte für die PCR- und LAMP-Technik vor.

Amplifikationsverfahren sind die biochemischen Arbeitspferde des molekular­diagnostischen Labors. Gibt man den Poly­merasen ausreichend Futter und sorgt für ein angenehmes Milieu ohne Fremd-DNA, Nukleasen und Inhibitoren, dann sind sie fleißig, und die Reaktion läuft und läuft und läuft...
Trotz aller Fortschritte der Nukleinsäure-Analytik – von DNA-Microarrays bis zum Next Generation Sequencing – sind PCR1, LAMP2 & Co. durch nichts zu ersetzen. In der medizinischen Diagnostik dienen sie vor allem der Identifikation und Quantifizierung infektiöser Erreger sowie der Erkennung erblicher und erworbener Mutationen. Daneben benötigt man sie als Bestätigungstests für innovative Verfahren und zur Produktion von Ausgangsmaterial für die Sequenzierung.

 

zur Tabelle Amplifikation / Detektion



Realtime-PCR
Durch die Einführung von hitzestabilen Polymerasen aus Archaebakterien konnte die PCR deutlich vereinfacht und kostengünstiger durchgeführt werden. Und dank der Realtime-PCR wurde die Elektrophorese zur Auswertung der eigentlichen PCR entbehrlich; die Detektion von Fluoreszenzsignalen bei Entstehung spezifischer Amplifikate erlaubt jetzt im Echtzeit-Verfahren eine kontinuierliche Quantifizierung der Messergebnisse. Bei geschickter Wahl der Farbstoffe können mehrere Nachweise in einem Reaktionsgefäß parallel durchgeführt werden (Multiplex-PCR). Voraussetzung dafür sind ausreichend weit auseinanderliegende Anregungs- und Absorptionswellenlängen, um störende Überlappungen zu vermeiden.

Isotherme Amplifikation

Das hier vorgestellte LAMP-Verfahren (s. Abb.) gehört zu den isothermen Methoden, die bei einer konstanten Temperatur um die 65 °C arbeiten. Der wesentliche Trick besteht im Einsatz sog. Hybridprimer und einer Strand-Displacement-Polymerase, die im Gegensatz zur PCR einsträngige DNA-Amplifikate produziert.
Vier der fünf in der folgenden Tabelle vorgestellten Geräte nutzen das PCR-Verfahren, sind also Thermocycler. Bei Zweien handelt es sich um baugleiche Geräte – Hersteller Qiagen und dessen Distributor Vela Diagnostics – die aber jeweils eigene Steuerungs- und Auswertungssoftware und eigene Testkits verwenden. Die exakten Temperaturzyklen für die PCR werden mit Peltier- (Bio-Rad und Hain) oder Heizelementen und Luftkühlung (Airflow; Qiagen und Vela) erzeugt. Die Temperaturgenauigkeit und Uniformität sind – angepasst an die Zielsetzung der Reaktion – unterschiedlich hoch. Hain Lifescience stellt hier eine qualitative, fluoreszenz-basierte Endpunkt-PCR vor, alle anderen Verfahren arbeiten kinetisch. Die zulässigen Temperaturschwankungen sind mit 0,2 bis 0,8 °C durchweg gut.
Das fünfte Gerät verwendet das bereits angesprochene isotherme LAMP-Verfahren: DiaSorin hat es quantifizierbar und multiplexfähig gemacht (Q-LAMP).
Beide Verfahren basieren auf Fluoreszenzsignalen. Als Anregungslichtquellen dienen ausnahmslos LEDs; für die Detektion sind die Geräte mit Photodioden (Bio-Rad, DiaSorin, Hain Lifescience) oder Photomultipliern (Qiagen, Vela Diagnostics) ausgestattet. Enge Wellenlängenbereiche für Anregung und Detektion werden mit Filtern eingestellt. Die Geräuschemission der Geräte bewegt sich in einem Bereich zwischen 51, 5 (DiaSorin) und 57 dB (Bio-Rad). Das entspricht in etwa dem Geräuschpegel in einem Raum, in dem mit normaler Lautstärke gesprochen wird.
Vier Geräte verfügen über mehrere Kanäle, sind also multiplexfähig. Zur Auswertung der Messdaten wird geeignete Software mitgeliefert, die bei Qiagen und Vela Diagnostics auch High Resolution Melt-Messungen (HRM) unterstützt. Bio-Rad kann bis zu 96 Proben, Vela Diagnostics bis zu 72 und Qiagen bis zu 100 Proben gleichzeitig messen. DiaSorin und Hain Lifescience bieten kleine Batchgrößen an, erreichen aber durch mehrere aneinander gekoppelte Geräte einen Random Access-Modus und eine höhere Probenzahl (DiaSorin bis zu sechs, Hain Lifescience bis zu acht Geräte).
Jede Firma stellt fertige Kits zur Verfügung, die alle benötigten Reagenzien, insbesondere Substrate, Enzyme und Kontrollmaterialien enthalten. Nachfolgend finden Sie eine Auswahl aus dem umfangreichen Portfolio der teilnehmenden Firmen.  
Dr. Gabriele Egert, Mitglied der Redaktion

 

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